[發(fā)明專利]新型冠狀病毒滅活疫苗中新型冠狀病毒S蛋白含量的檢測方法

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• 申請日: 2021-01-15
• 公開（公告）號: CN112684060A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發(fā)明（設計）人: 王輝;馬昱;張雅博;趙玉秀;于守智;張越;楊曉明
• 申請（專利權）人: 北京生物制品研究所有限責任公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/54;G01N30/72;G01N30/88;C07K14/165;G01N33/68
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 劉鑫;姚亮

1.一種用于液相色譜串聯(lián)質譜定量檢測新型冠狀病毒S蛋白的定量肽段，其氨基酸序列如下：

GWIFGTTLDSK(SEQ ID NO：1)。

2.根據(jù)權利要求1所述的定量肽段，其中，所述定量肽段的定量離子對中母離子的質荷比為612.8161，子離子的質荷比為244.1080和/或216.1080。

3.權利要求1或2所述定量肽段在液相色譜串聯(lián)質譜定量檢測新型冠狀病毒S蛋白中的應用。

4.一種新型冠狀病毒滅活疫苗中新型冠狀病毒S蛋白含量的檢測方法，其包括以下步驟：

對重組新型冠狀病毒SARS-CoV-2的S蛋白標準品進行孵育并進行酶解處理；采用高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜分析檢測設備，進樣酶解處理后的重組新型冠狀病毒SARS-CoV-2的S蛋白標準品，以標準品含量為橫坐標，以權利要求1或2所述的定量肽段的子離子峰面積為縱坐標繪制標準曲線；

取待測新型冠狀病毒SARS-CoV-2的滅活疫苗樣品進行孵育并進行酶解處理；將酶解后的上清液進樣檢測，根據(jù)所述定量肽段的子離子峰面積，基于標準曲線和進樣體積獲得待測的滅活疫苗樣品中新型冠狀病毒SARS-CoV-2的定量肽段的含量，除以進樣體積，即得到待測的滅活疫苗樣品中新型冠狀病毒S蛋白的濃度。

5.根據(jù)權利要求4所述的檢測方法，其中，重組新型冠狀病毒SARS-CoV-2的S蛋白標準品或待測新型冠狀病毒SARS-CoV-2的滅活疫苗樣品進行孵育的過程包括：

向重組新型冠狀病毒SARS-CoV-2的S蛋白標準品或待測的滅活疫苗樣品中等體積加入RapiGEST，于70～90℃條件下孵育20～60min后，接著加入二硫蘇糖醇至終濃度為25mmol/L，于65℃條件下孵育60min，溫度降至室溫后加入碘代乙酰胺溶液至終濃度為50mmol/L，避光室溫孵育20～60min。

6.根據(jù)權利要求4或5所述的檢測方法，其中，孵育后進行酶解處理的過程包括：

向220μL孵育后的重組新型冠狀病毒SARS-CoV-2的S蛋白標準品或孵育后的待測的滅活疫苗樣品中加入NH₄HCO₃溶液至體積為480μL，接著加入胰蛋白酶溶液20μL，于37℃條件下過夜酶解，酶解反應完成后，加入1μL的甲酸以使胰蛋白酶失活，即結束酶解反應。

7.根據(jù)權利要求4所述的檢測方法，其中，重組新型冠狀病毒SARS-CoV-2的S蛋白標準品或待測新型冠狀病毒SARS-CoV-2的滅活疫苗樣品的高效液相色譜檢測條件如下：

色譜柱：C18柱，優(yōu)選選用ACQUITY UPLC PEPTIDE BEH C18(2.1mm×100mm)，進樣量為5～10μL，色譜柱溫度為60℃；

流動相組成：流動相A為0.1％甲酸水溶液，流動相B為含0.1％甲酸的乙腈溶液；流動相B在0～20min內含量從0～45％變化進行梯度洗脫，流速為0.3mL/min。

8.根據(jù)權利要求4所述的檢測方法，其中，重組新型冠狀病毒SARS-CoV-2的S蛋白標準品或待測新型冠狀病毒SARS-CoV-2的滅活疫苗樣品的質譜檢測條件如下：

離子源參數(shù)：霧化器流量3.0L/min，干燥器流量10.0L/min，接口溫度300℃，脫溶劑氣溫度526℃，電噴霧電壓3.0kV；DL溫度250℃。

9.根據(jù)權利要求4或8所述的檢測方法，其中，母離子質荷比為612.8161、子離子質荷比為244.1080的定量離子對的Q1 Pre偏差(v)-20.0；CE＝-20；Q3 Pre偏差(v)-17.0。

10.根據(jù)權利要求4或8所述的檢測方法，其中，母離子質荷比為612.8161、子離子質荷比為216.1080的定量離子對的Q1 Pre偏差(v)-15.0；CE＝-24；Q3 Pre偏差(v)-15.0。