[發明專利]新型冠狀病毒滅活疫苗中新型冠狀病毒S蛋白含量的檢測方法

在審

• 申請號: 202110052933.5
• 申請日: 2021-01-15
• 公開（公告）號: CN112684060A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 王輝;馬昱;張雅博;趙玉秀;于守智;張越;楊曉明
• 申請（專利權）人: 北京生物制品研究所有限責任公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/54;G01N30/72;G01N30/88;C07K14/165;G01N33/68
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 劉鑫;姚亮

本發明提供新型冠狀病毒滅活疫苗中新型冠狀病毒S蛋白含量的檢測方法。該檢測方法利用了本發明的定量肽段(GWIFGTTLDSK)；定量肽段的離子對中母離子的質荷比為612.8161，子離子的質荷比為244.1080和/或216.1080。利用該定量肽段和定量離子對，通過高效液相色譜串聯質譜定量檢測方法，S蛋白標準品制作標準曲線，將待測新冠病毒疫苗孵育酶解后進行定量檢測，得到樣品中定量肽段的子離子峰面積，進而計算得到樣品中新型冠狀病毒S蛋白的含量。該方法檢測準確率高，精確度高，避免了疫苗樣品中基質效應等對檢測的影響，能夠用于新冠病毒滅活疫苗各階段中間產品及成品的新冠病毒S蛋白含量檢測。

技術領域

本發明屬于新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)滅活疫苗檢測技術領域，涉及新型冠狀病毒滅活疫苗中新型冠狀病毒S蛋白含量的檢測方法，尤其涉及利用液相色譜串聯質譜定量檢測新型冠狀病毒滅活疫苗中新型冠狀病毒S蛋白含量的方法。

背景技術

2019年底發現的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)疫情迅速席卷全球，對全球各地區人民的生命健康和社會的經濟發展都帶來巨大的損失。SARS-CoV-2病毒直徑在為60～140nm，主要有4種結構蛋白，分別為S(棘突)蛋白、N(核衣殼)蛋白、M(膜)蛋白、E(包膜)蛋白。其中，S蛋白是病毒最重要的表面膜蛋白，也是引起免疫應答的重要抗原，是疫苗設計的關鍵靶點。疫苗作為狙擊和預防新冠病毒的一種有效方式，成為全球藥物研發的關注焦點。滅活疫苗是針對新發突發傳染病最有效的疫苗研發途徑。具有生產工藝成熟、質量標準可控、保護范圍廣等優點，可用于大規模接種，并且有國際通行標準來判斷疫苗的安全性和有效性。滅活疫苗中有效抗原含量的檢測尤為關鍵。

滅活疫苗是針對新發突發傳染病最有效的疫苗研發途徑。具有生產工藝成熟、質量標準可控、保護范圍廣等優點，可用于大規模接種，并且有國際通行標準來判斷疫苗的安全性和有效性。滅活疫苗中有效抗原含量的檢測，如新冠病毒中S蛋白和N蛋白的含量測定，對于疫苗評價有著十分重要的意義。

傳統方法檢測滅活疫苗中新型冠狀病毒S蛋白含量需要依靠免疫學分析方法，如雙抗體夾心酶聯免疫法檢測。采用酶聯免疫技術檢測新型冠狀病毒中的S蛋白，利用重組表達S蛋白抗原，通過基礎免疫和加強免疫小鼠或家兔，制備單克隆或多克隆抗體。將純化后抗S蛋白抗體包被固相載體如酶聯反應板，封閉干板后，加入待測產品，進行孵育洗板操作后，加入酶標記的抗S蛋白抗體，形成標記后的免疫復合物，通過洗滌，將未被結合的酶結合物以及其它物質去除。通過顯色或者發光等方式對標記物進行檢測，通過標準曲線可以定量檢測待測產品中SARS-CoV-2的S蛋白含量。利用酶聯法檢測S蛋白的技術需要大量時間通過動物免疫過程制備特異性抗體，且對抗體質量要求較高，不僅需要極高的特異性，而且抗體一般需要較高的親和力。酶聯免疫實驗在檢測過程中易受檢測樣本中其它成分干擾影響測定結果，造成定量不準確。酶聯免疫技術實驗操作過程復雜，需要進行3～5步驟孵育和酶聯反應板洗滌操作，人為因素對實驗影響較大，而且去反應過程易受環境因素影響，故其穩定性和重復性較差。由于酶聯免疫法線性范圍較窄，一般為10²，對于未知濃度樣品需要進行預實驗或樣品稀釋，才能將樣品落在最佳線性范圍內得到準確測定，而過多的稀釋過程一般會造成的樣品檢測的不準確。

近年來，液相色譜串聯質譜技術在蛋白質的檢測分析方面具有高選擇性和高靈敏度等優點，非常適用于復雜生物基質中靶向蛋白質的定性和定量研究。

發明內容