[發明專利]耐受阿魏酸和香草酸的解脂耶氏酵母工程菌及其構建方法

有效

• 申請號: 202110049160.5
• 申請日: 2021-01-14
• 公開（公告）號: CN112625932B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發明（設計）人: 金明杰;王澤迪;周琳琳;許召賢
• 申請（專利權）人: 南京理工大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/31;C12N15/81;C12R1/645
• 代理公司: 南京理工大學專利中心 32203
• 代理人: 劉海霞

本發明公開了一種耐受阿魏酸和香草酸的解脂耶氏酵母工程菌及其構建方法。本發明利用基因工程的方法，構建過量表達YALI0_E25201g、YALI0_B18854g和YALI0_F16731g三個基因中的一種或兩種以上的解脂耶氏酵母工程菌，使其對木質纖維素水解液中的阿魏酸和香草酸的耐受性增加，緩解木質纖維素水解液中阿魏酸和香草酸對解脂耶氏酵母利用木質纖維素水解液生產微生物油脂產生的負面影響。與帶有對照質粒的對照菌株yl?XYL+control相比，本發明的解脂耶氏酵母基因工程菌在含有阿魏酸的培養基和含有香草酸的培養基中的生長情況顯著改善。

技術領域

本發明屬于基因工程菌技術領域，涉及一種耐受阿魏酸和香草酸的解脂耶氏酵母工程菌及其構建方法。

背景技術

木質纖維素是地球上最豐富的生物質資源，利用木質纖維素生產生物燃料（如生物柴油）具有重大的經濟價值和戰略意義。由于其結構的致密性，木質纖維素必須經過預處理后才能水解為可發酵的糖。但在預處理過程中，隨著木質纖維素的降解會釋放大量的抑制物，主要包括弱酸類、呋喃類化合物和酚類化合物。弱酸類抑制物（如甲酸、乙酸等）進入細胞后會引起細胞內pH變化，酵母等菌株會消耗過量ATP維持細胞內酸堿平衡，影響菌株生長和油脂積累；呋喃類化合物（如糠醛、羥甲基糠醛等）會影響菌株的氧化還原平衡并抑制糖酵解途徑中相關酶的活性，同時延長了菌株生長的延滯期；酚類化合物（如丁香酸、阿魏酸等）會影響細胞膜的完整性和滲透性，甚至導致細胞膜的破裂，此外，酚類化合物產生的活性氧（reactive oxygen species，如過氧化氫（H₂O₂）、超氧化物（O^2-）和超羥基（OH^-）等）會與蛋白質相互作用并導致其失活，破壞菌株代謝活動。抑制物的產生不可避免，雖然可以通過對預處理后的反應液進行脫毒處理來降低對發酵的抑制作用，但脫毒操作不僅會增加工業生產成本，也可能造成可發酵糖的損失。研究菌株對抑制物的響應機制有助于木質纖維素生物柴油的實際生產應用，也為通過基因工程構建魯棒性更強的整合菌株提供理論依據。

解脂耶氏酵母是研究最多的非常規酵母之一，已經被美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration）認定為食品安全性酵母。它廣泛分布于富含脂質和蛋白質的環境中，并且具有很強的分解疏水化合物的能力。解脂耶氏酵母作為工程菌株已經有60多年的歷史，可以用來生產單細胞蛋白、TAGs、脂肪酸衍生物、有機酸和類胡蘿卜素等產品。野生型解脂耶氏酵母可以積累超過自身干重20%的油脂，最近解脂耶氏酵母通過基因工程改造已經可以積累自身細胞干重90%的油脂，因此，解脂耶氏酵母是一種極佳的生物油脂轉化細胞底盤。

目前，酵母對木質纖維素水解液中抑制物的耐受研究主要集中在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。釀酒酵母耐受抑制物的機制主要分為三類：第一類是細胞對抑制物的直接響應，包括1)多藥轉運蛋白去除胞內抑制物和2)胞內相關酶催化抑制物降解；第二類是為了消除因接觸抑制物而造成的損傷所誘導的間接機制，抑制物會損傷菌株的細胞膜或細胞壁(3)，也會抑制某些蛋白的功能(4)，所以需要細胞增加相關保護代謝物的合成(5)來修復損傷；第三類為其他機制，如6)輔因子再生以協助抑制物的降解，輔因子再生包括通過7)磷酸戊糖途徑進行輔助因子再生和8)用于抵消由抑制物引起的活性氧自由基(ROS)積累的輔助因子再生。但是解脂耶氏酵母對抑制物的耐受機制研究較少，阻礙了對酵母細胞抑制物壓力響應機制的深入了解和木質纖維素生物柴油的進一步發展。

發明內容

本發明的目的在于提供一種耐受阿魏酸和香草酸的解脂耶氏酵母工程菌及其構建方法。

本發明所述的耐受阿魏酸和香草酸的解脂耶氏酵母工程菌，為過量表達YALI0_E25201g、YALI0_B18854g和YALI0_F16731g中的一種或兩種以上的解脂耶氏酵母工程菌。