[發明專利]一種快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內DNA的方法

在審

• 申請號: 202110048481.3
• 申請日: 2021-01-14
• 公開（公告）號: CN112680437A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 林蠡;劉廣鑫
• 申請（專利權）人: 林蠡;劉廣鑫
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華;劉艷麗

本發明公開了一種快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內DNA的方法，該方法通過dd H₂O、ET和ETS buffer三種溶液及物理變溫的方法快速通過單菌落制備PCR擴增模板，直接跳過了菌種的擴培與DNA提取步驟，該方法快速便捷，大大降低了檢測周期、檢測成本以及勞動力輸出。

技術領域

本發明屬于水產養殖技術領域，具體涉及一種快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內DNA的方法。

背景技術

芽孢桿菌屬(Bacillus)，細菌的一屬，革蘭氏陽性菌，能形成芽孢(內生孢子)。芽孢桿菌可分泌多種胞外蛋白酶、水解酶、抗菌肽等可有效降解水體中有機物并抑制養殖水體中病原菌的增殖，也可以高效同化養殖水體中對經濟動物有毒害作用的無機氮、硫化氫等物質來實現水質凈化效果。同時因生命力強、耐受程度高、可產生芽孢等特點為工業生產及水產養殖領域中的臨床應用提供了有利的條件。芽孢桿菌作為異養微生物菌種是水產養殖領域中對水質凈化、調節腸道菌群等方面應用最為廣泛的菌種之一。

近年來，隨著我國水產養殖業的快速發展，芽孢桿菌微生態制劑產品在經濟魚類、蝦蟹、貝類等養殖過程中被大量的使用，其施用效果也得到了眾多研究學者和養殖戶所認可。芽孢桿菌微生態制劑在制備和施用過程中，需定期監測相應過程中目的菌種來進行污染評價和產品效果評估。而芽孢桿菌作為革蘭氏陽性菌，僅通過加熱的方式不能實現菌種破壁，且暫無有效破壁革蘭氏陽性菌試劑盒，所以只能通過液氮研磨的方式對革蘭氏陽性菌進行破壁及DAN釋放。此過程需投入大量的時間成本、試劑成本和勞動力成本等。

本發明僅通過ddH₂O、ET和ETS三種溶液，分別進行反復凍融便實現了革蘭氏陽性菌的DNA釋放，從而降低了檢測成本、縮短了檢測周期，為革蘭氏陽性菌的快速鑒定提供了可行性的方法。

就目前的菌種鑒定流程還停留在傳統的細菌培養鑒定步驟，此評價過程涉及到單菌落的大量挑選、擴培及后續的DNA提取和鑒定步驟，主要包括：

(1)水體中和經濟動物體表、腸道等樣品平板涂布和單菌落培養，待菌落長成可用接種環挑取為準(24-48h)；

(2)使用細菌瓶對挑取的單菌落進行擴大培養，OD₆₀₀1.0以上(24-48h)；

(3)收集菌液中的菌體并使用細菌DNA提取試劑盒進行DNA提取(2-4h)；

(4)利用16S通用引物對提取的DNA進行PCR擴增及凝膠電泳檢測(3-5h)；

(5)送到DNA核酸序列檢測公司并進行測序分析。

(6)利用NCBI_BLAST：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi在線軟件對測序獲得的16S序列進行比對、分析，確定菌種名稱。

現階段使用的上述常規16S菌種鑒定技術，具有靈敏度高、特異性強、操作簡單等特點而被廣泛應用到各行各業中。但是此檢測方法僅對革蘭氏陰性菌的檢測具有效果，不能直接對革蘭氏陽性菌進行檢測，且目前對于革蘭氏陽性菌的菌種鑒定中涉及的DNA模板制備已成為了革蘭氏陽性菌檢測的重要阻力。

因此，目前水產養殖行業中對菌種的鑒定由于檢測頻率高、檢測周期長、樣品數量大、檢測成本高、人工投入大等特點而很難得到普及和推廣，且目前市面上對于革蘭氏陽性菌破壁及DNA提取暫無特效的試劑及試劑盒。因此傳統的DNA提取步驟及鑒定方法并不適用革蘭氏陽性菌的菌種鑒定。

發明內容

本發明的目的在于提供一種快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內DNA的方法，該方法通過加入dd H₂O、ET和ETS buffer三種溶液及物理變溫的方法快速通過單菌落制備PCR擴增模板，直接跳過了菌種的擴培與DNA提取步驟，該方法快速便捷，大大降低了檢測周期、檢測成本以及勞動力輸出。