[發明專利]一種快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內DNA的方法

在審

• 申請號: 202110048481.3
• 申請日: 2021-01-14
• 公開（公告）號: CN112680437A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 林蠡;劉廣鑫
• 申請（專利權）人: 林蠡;劉廣鑫
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華;劉艷麗

1.一種快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內DNA的方法，其特征是包括以下步驟：

(1)選取待測樣品，采用固體培養基進行平板涂布或劃線；

(2)采用封口膜封住平板，并置于培養箱培養；

(3)取出平板，挑取單菌落接種于含有ddH₂O的Eppendorf管中，并將單菌落吹散，先置于冰水混合物中，再置于冷凍裝置中迅速降低其溫度，待試管中ddH₂O凝結成冰后，靜置，迅速置于熱水浴中，使其溫度快速升高，然后靜置；

(4)取出含有單菌落的ddH₂O移入含有ET溶液的Eppendorf管，先置于冰水混合物中，再置于冷凍裝置中迅速降低其溫度，待試管中溶液凝結成冰后，靜置，迅速置于熱水浴中，使其溫度快速升高，然后靜置；

(5)向步驟(4)中含有ET溶液的Eppendorf管中加入十二烷基硫酸鈉，先置于冰水混合物中，再置于冷凍裝置中迅速降低其溫度，待試管中溶液凝結成冰后，靜置，迅速置于熱水浴中，使其溫度快速升高，然后靜置；

(6)取上清液，即得革蘭氏陽性菌種胞內DNA。

2.根據權利要求1所述的快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內DNA的方法，其特征是：步驟(1)中所述的待測樣品為革蘭氏陽性菌微生態制劑或養殖水體水樣；步驟(1)中所述固體培養基為LB固體培養基或TCBS固體培養基。

3.根據權利要求1所述的快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內DNA的方法，其特征是：步驟(2)中置于28～37℃培養箱培養12～24h。

4.根據權利要求1所述的快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內DNA的方法，其特征是：步驟(3)中取出平板，挑取單菌落接種于含有30～50μL ddH₂O的Eppendorf管中，并將單菌落吹散，先置于冰水混合物中3～5分鐘，再置于冷凍裝置中迅速降低其溫度，待試管中ddH₂O凝結成冰后，靜置5～10min，迅速置于熱水浴中，使其溫度快速升高至95～100℃，然后靜置10～20min。

5.根據權利要求1所述的快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內DNA的方法，其特征是：步驟(4)中取出含有單菌落的ddH₂O移入含有30～50μL ET溶液的Eppendorf管，先置于冰水混合物中3～5分鐘，再置于冷凍裝置中迅速降低其溫度，待試管中溶液凝結成冰后，靜置5～10min，迅速置于熱水浴中，使其溫度快速升高至95～100℃，然后靜置10～20min。

6.根據權利要求1或5所述的快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內DNA的方法，其特征是：步驟(4)中所述ET溶液包括EDTA和Tris-Cl，其中所述EDTA和Tris-Cl的終濃度為0.02mol/L。

7.根據權利要求1所述的快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內DNA的方法，其特征是：步驟(5)中向步驟(4)中含有ET溶液的Eppendorf管中加入十二烷基硫酸鈉使其終濃度為3～4％。

8.根據權利要求1所述的快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內DNA的方法，其特征是：步驟(5)中向步驟(4)中含有ET溶液的Eppendorf管中加入十二烷基硫酸鈉，先置于冰水混合物中3～5分鐘，再置于冷凍裝置中迅速降低其溫度，待試管中溶液凝結成冰后，靜置5～10min，迅速置于熱水浴中，使其溫度快速升高95～100℃，然后靜置10～20min。

9.根據權利要求1所述的快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內DNA的方法，其特征是：步驟(3)～(5)中置于-20℃以下冷凍裝置中迅速降低其溫度。

10.根據權利要求1所述的快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內DNA的方法，其特征是：步驟(6)中所述上清液，進一步置于含有PCR反應液的PCR管中作為PCR模板，然后置于PCR儀中進行PCR擴增，其中前期非循環反應中的變性溫度為95℃，變性時間為10min。