[發(fā)明專利]一種快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內(nèi)DNA的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110048481.3 | 申請日： | 2021-01-14 |
| 公開（公告）號： | CN112680437A | 公開（公告）日： | 2021-04-20 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 林蠡;劉廣鑫 | 申請（專利權(quán)）人： | 林蠡;劉廣鑫 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10;C12Q1/6806 |
| 代理公司： | 廣州知友專利商標(biāo)代理有限公司 44104 | 代理人： | 宣國華;劉艷麗 |
| 地址： | 510199 廣*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 快速 釋放 革蘭氏 陽性 菌種 dna 方法 | ||
1.一種快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內(nèi)DNA的方法，其特征是包括以下步驟：
(1)選取待測樣品，采用固體培養(yǎng)基進(jìn)行平板涂布或劃線；
(2)采用封口膜封住平板，并置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
(3)取出平板，挑取單菌落接種于含有ddH2O的Eppendorf管中，并將單菌落吹散，先置于冰水混合物中，再置于冷凍裝置中迅速降低其溫度，待試管中ddH2O凝結(jié)成冰后，靜置，迅速置于熱水浴中，使其溫度快速升高，然后靜置；
(4)取出含有單菌落的ddH2O移入含有ET溶液的Eppendorf管，先置于冰水混合物中，再置于冷凍裝置中迅速降低其溫度，待試管中溶液凝結(jié)成冰后，靜置，迅速置于熱水浴中，使其溫度快速升高，然后靜置；
(5)向步驟(4)中含有ET溶液的Eppendorf管中加入十二烷基硫酸鈉，先置于冰水混合物中，再置于冷凍裝置中迅速降低其溫度，待試管中溶液凝結(jié)成冰后，靜置，迅速置于熱水浴中，使其溫度快速升高，然后靜置；
(6)取上清液，即得革蘭氏陽性菌種胞內(nèi)DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內(nèi)DNA的方法，其特征是：步驟(1)中所述的待測樣品為革蘭氏陽性菌微生態(tài)制劑或養(yǎng)殖水體水樣；步驟(1)中所述固體培養(yǎng)基為LB固體培養(yǎng)基或TCBS固體培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內(nèi)DNA的方法，其特征是：步驟(2)中置于28～37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～24h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內(nèi)DNA的方法，其特征是：步驟(3)中取出平板，挑取單菌落接種于含有30～50μL ddH2O的Eppendorf管中，并將單菌落吹散，先置于冰水混合物中3～5分鐘，再置于冷凍裝置中迅速降低其溫度，待試管中ddH2O凝結(jié)成冰后，靜置5～10min，迅速置于熱水浴中，使其溫度快速升高至95～100℃，然后靜置10～20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內(nèi)DNA的方法，其特征是：步驟(4)中取出含有單菌落的ddH2O移入含有30～50μL ET溶液的Eppendorf管，先置于冰水混合物中3～5分鐘，再置于冷凍裝置中迅速降低其溫度，待試管中溶液凝結(jié)成冰后，靜置5～10min，迅速置于熱水浴中，使其溫度快速升高至95～100℃，然后靜置10～20min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內(nèi)DNA的方法，其特征是：步驟(4)中所述ET溶液包括EDTA和Tris-Cl，其中所述EDTA和Tris-Cl的終濃度為0.02mol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內(nèi)DNA的方法，其特征是：步驟(5)中向步驟(4)中含有ET溶液的Eppendorf管中加入十二烷基硫酸鈉使其終濃度為3～4％。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內(nèi)DNA的方法，其特征是：步驟(5)中向步驟(4)中含有ET溶液的Eppendorf管中加入十二烷基硫酸鈉，先置于冰水混合物中3～5分鐘，再置于冷凍裝置中迅速降低其溫度，待試管中溶液凝結(jié)成冰后，靜置5～10min，迅速置于熱水浴中，使其溫度快速升高95～100℃，然后靜置10～20min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內(nèi)DNA的方法，其特征是：步驟(3)～(5)中置于-20℃以下冷凍裝置中迅速降低其溫度。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速釋放革蘭氏陽性菌種胞內(nèi)DNA的方法，其特征是：步驟(6)中所述上清液，進(jìn)一步置于含有PCR反應(yīng)液的PCR管中作為PCR模板，然后置于PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中前期非循環(huán)反應(yīng)中的變性溫度為95℃，變性時間為10min。
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