[發(fā)明專利]非洲豬瘟病毒三重?zé)晒釶CR檢測試劑盒及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110048006.6
• 申請日: 2021-01-14
• 公開（公告）號: CN112375849A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉河冰;曹罡;王程玉;李蓉蓉;邱增枝
• 申請（專利權(quán)）人: 北京明日達(dá)科技發(fā)展有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
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• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種非洲豬瘟病毒三重?zé)晒釶CR檢測試劑盒及其制備方法與應(yīng)用。該檢測試劑盒包括熒光PCR反應(yīng)液、陽性對照、陰性對照、外源基因標(biāo)準(zhǔn)液、陰性提取對照液。所述熒光PCR反應(yīng)液包含VP72基因、外源基因、內(nèi)源基因的上、下游引物和探針。本發(fā)明通過設(shè)置內(nèi)源基因作為整個(gè)檢測過程中的內(nèi)部質(zhì)控，監(jiān)測樣本采集、提取和擴(kuò)增的全過程；設(shè)置外源基因作為核酸提取過程中的外部陽性質(zhì)控，將外源基因添加于樣本核酸提取過程中伴隨著樣本一起進(jìn)行核酸提取，根據(jù)外源基因PCR反應(yīng)Ct值的變化來監(jiān)測核酸提取試劑盒的核酸提取效果，增大了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，減少了假陰性結(jié)果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動(dòng)物病原分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種非洲豬瘟病毒三重?zé)晒釶CR檢測試劑盒及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fevervirus，ASFV）引起豬的一種急性、熱性、高度傳染性疾病。該病病程短，死亡率高，對養(yǎng)豬業(yè)危害甚大，為世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定須通報(bào)動(dòng)物疫病，也是我國重點(diǎn)防控的一類動(dòng)物疫病。2018年我國在遼寧省首次報(bào)告發(fā)現(xiàn)ASF疫情，隨后其擴(kuò)散蔓延到全國其他地區(qū)，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了極大經(jīng)濟(jì)損失。由于ASF的臨床癥狀和病理變化很難與豬瘟等其他疫病區(qū)分，并且目前沒有有效疫苗可用，因此快速準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷具有重要意義。經(jīng)典的血吸附試驗(yàn)、病毒分離鑒定等檢測診斷方法，對生物安全設(shè)施條件要求較高，在試驗(yàn)特異性以及檢測時(shí)間等方面也有所限制。相比之下，熒光PCR具有較高的敏感性和特異性，可同時(shí)快速檢測高通量樣品，被廣泛應(yīng)用于ASF診斷和檢測。

目前，主要有三個(gè)因素影響熒光PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即標(biāo)本因素（樣本的采集部位、樣品的質(zhì)量以及樣本的保存方法、保存時(shí)間等）、人員因素（實(shí)驗(yàn)人員的工作態(tài)度、技術(shù)水平以及在實(shí)際操作過程中的操作習(xí)慣等）、儀器因素（儀器設(shè)備的穩(wěn)定性、均勻度、光敏感感應(yīng)管、加熱退火的模塊和時(shí)間、激發(fā)燈管的強(qiáng)度、數(shù)據(jù)分析的難易程度）。針對以上技術(shù)問題，本發(fā)明通過設(shè)計(jì)ASFV VP72基因、外源基因、內(nèi)源基因三重特異性引物與探針，監(jiān)測樣本采集、提取和擴(kuò)增的全過程，解決熒光PCR檢測過程中因采樣不規(guī)范、核酸提取操作失誤造成的假陰性、假陽性現(xiàn)象，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種非洲豬瘟病毒三重?zé)晒釶CR檢測試劑盒，包括熒光PCR反應(yīng)液、陽性對照、陰性對照、外源基因標(biāo)準(zhǔn)液、陰性提取對照液；所述熒光PCR反應(yīng)液包含2×TaqMan? Fast Advanced Master Mix及VP72基因、外源基因、內(nèi)源基因的上、下游引物和探針。其中，VP72基因?yàn)榉侵挢i瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP72基因片段，外源基因?yàn)槿斯ず铣傻奶禺愋曰蚱危╓Y基因）、內(nèi)源為豬肌動(dòng)蛋白β-actin基因片段（Pactin基因）。

上述三對特異性引物序列為：

VP72-F：5’-GTGGAAGGGTATGTAAGAGCTG-3’，如SEQ ID NO.1所示；

VP72-R：5’-AATGTTTTTAATAATAGGTAATGTG-3’， 如SEQ ID NO.2所示；

WY-F：5’-CGGGTGATTCGCAAGATCTTG-3’，如SEQ ID NO.3所示；

WY-R：5’-CCAGTGTAGAGAAGGAAAAT-3’ ，如SEQ ID NO.4所示；

Pactin-F：5’-TTGTCATGGACTCTGGGGATGG-3’，如SEQ ID NO.5所示；

Pactin-R：5’-AGTCCTGCGGCATCCACGAGACCA-3’，如SEQ ID NO.6所示。

特異性探針序列為：