[發明專利]一種tTIM融合蛋白疫苗、制備方法及應用

在審

• 申請號: 202110047923.2
• 申請日: 2021-01-14
• 公開（公告）號: CN112807425A
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 莫麗華;劉大波;羅向前
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學深圳醫院
• 主分類號: A61K39/35
• 分類號: A61K39/35;A61K39/00;A61P37/08;A61P11/00;C12N15/70;C12N15/62;C07K19/00
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

本發明屬于疫苗制備技術領域，公開了一種tTIM融合蛋白疫苗、制備方法及應用，獲取TAT48?60、T?bet、MHC?II基因序列；預測OVA的主要T細胞表位AI?15、VE?15、GI?15、IC?15；篩選出OVA優勢T細胞表位IC?15；合成TAT?T?bet?IC?15?MHC?II融合基因和無攜帶TAT48?60的T?bet?IC?15?MHC?II融合基因；將tTIM融合基因克隆到pET?32a表達載體上并轉化入大腸埃希菌工程菌中；表達tTIM融合蛋白；確定tTIM融合蛋白疫苗制備的最佳工藝條件。本發明能夠平衡Th1/Th2比率維持機體免疫系統的穩態，從而抑制過敏性炎癥反應。

技術領域

本發明屬于疫苗制備技術領域，尤其涉及一種tTIM融合蛋白疫苗、制備方法及應用。

背景技術

目前，隨著全球呼吸道過敏性疾病患病率不斷攀升，人類的健康收到嚴重危害。呼吸道過敏性疾病發病機制的關鍵因素是機體免疫系統Th1/Th2細胞比例的失衡。近幾十年，國內外針對維持免疫系統穩定的研究進展迅速，但在如何通過靶向抗原特異性T細胞抑制Th2炎癥反應治療呼吸道過敏性疾病研究方面仍處于探索階段。

目前臨床上有以抗組胺或激素等對癥治療來緩解病情，而糖皮質激素及抗組胺藥物是目前臨床用來緩解過敏性疾病臨床癥狀的主要藥物，但是它對機體免疫系統的抑制特別是對IFN-γ的抑制，降低了機體防御感染的能力，難以取得滿意的療效。

通過上述分析，現有技術存在的問題及缺陷為：

(1)現有的通過靶向抗原特異性T細胞抑制Th2炎癥反應治療呼吸道過敏性疾病研究方面仍處于探索階段。

(2)目前臨床上有以抗組胺或激素等對癥治療來緩解病情的方法，對機體免疫系統的抑制特別是對IFN-γ的抑制，降低了機體防御感染的能力，難以取得滿意的療效。

解決以上問題及缺陷的難度為：由于外源性蛋白在機體內需經過APC細胞攝取后進行降解、加工處理才能將抗原信息提呈給T淋巴細胞，這直接限制了疫苗保持其自身結構的完整性、并直接進入抗原特異性T細胞起免疫調節作用的功能，嚴重妨礙了新型高效疫苗的研發。

解決以上問題及缺陷的意義為：借助TAT48-60滲透細胞膜以及MHC-II-抗原復合物的靶向性作用，使融合蛋白疫苗能夠直接穿透細胞膜、靶向性的進入抗原特異性T細胞中起免疫調節功能。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種tTIM融合蛋白疫苗、制備方法及應用。

本發明是這樣實現的，一種tTIM融合蛋白疫苗的制備方法，所述tTIM融合蛋白疫苗的制備方法包括以下步驟：

步驟一，在線網站獲取TAT48-60、T-bet、MHC-II基因序列。

步驟二，通過軟件Propred.MHC Class-II Binding Peptide Prediction Server預測OVA的主要T細胞表位AI-15、VE-15、GI-15、IC-15。

步驟三，利用過敏性哮喘小鼠的血清和小鼠抗OVAIgG為一抗，通過Western Blot和ELISA篩選出OVA優勢T細胞表位IC-15。

步驟四，以linker將TAT48-60、T-bet、MHC-II基因序列與篩選出的OVA主要抗原表位IC-15短肽基因序列進行連接，合成TAT-T-bet-IC-15-MHC-II融合基因，同時合成無攜帶TAT48-60的T-bet-IC-15-MHC-II融合基因。

步驟五，將tTIM融合基因克隆到pET-32a表達載體上并轉化入大腸埃希菌工程菌中。

步驟六，大腸埃希菌BL21經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG誘導培養，表達tTIM融合蛋白。