[發明專利]一種tTIM融合蛋白疫苗、制備方法及應用

在審

• 申請號: 202110047923.2
• 申請日: 2021-01-14
• 公開（公告）號: CN112807425A
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 莫麗華;劉大波;羅向前
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學深圳醫院
• 主分類號: A61K39/35
• 分類號: A61K39/35;A61K39/00;A61P37/08;A61P11/00;C12N15/70;C12N15/62;C07K19/00
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 陳炳萍

1.一種tTIM融合蛋白疫苗的制備方法，其特征在于，所述tTIM融合蛋白疫苗的制備方法包括：

在線網站獲取TAT48-60、T-bet、MHC-II基因序列；

通過軟件Propred.MHC Class-II Binding Peptide Prediction Server預測OVA的主要T細胞表位AI-15、VE-15、GI-15、IC-15；

利用過敏性哮喘小鼠的血清和小鼠抗OVAIgG為一抗，通過Western Blot和ELISA篩選出OVA優勢T細胞表位IC-15；

以linker將TAT48-60、T-bet、MHC-II基因序列與篩選出的OVA主要抗原表位IC-15短肽基因序列進行連接，合成TAT-T-bet-IC-15-MHC-II融合基因，同時合成無攜帶TAT48-60的T-bet-IC-15-MHC-II融合基因；

將tTIM融合基因克隆到pET-32a表達載體上并轉化入大腸埃希菌工程菌中；

大腸埃希菌BL21經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG誘導培養，表達tTIM融合蛋白；

通過6His-tag蛋白純化系統純化tTIM融合蛋白，確定tTIM融合蛋白疫苗制備的最佳工藝條件。

2.如權利要求1所述的tTIM融合蛋白疫苗的制備方法，其特征在于，所述TAT48-60的基因序列為GRKKRRQRRRPPQQ。

3.如權利要求1所述的tTIM融合蛋白疫苗的制備方法，其特征在于，所述T-bet的GeneID為57765，所述MHC-II的GenBank ID為111364。

4.如權利要求1所述的tTIM融合蛋白疫苗的制備方法，其特征在于，所述T細胞表位AI-15的基因序列為AMVYLGAKDSTRTQI，所述VE-15的基因序列為VVRFDKLPGFGDSIE，所述GI-15的基因序列為GLFRVASMASEKMKI，所述IC-15的基因序列為IKHIATNAVLFFGRC。

5.如權利要求1所述的tTIM融合蛋白疫苗的制備方法，其特征在于，所述小鼠抗OVAIgG多克隆抗體的制備方法，包括：

(1)通過南京的GenScript公司合成T細胞表位肽；

(2)制備小鼠抗OVAIgG多克隆抗體，對生產的抗體進行OVA特異性鑒定。

6.如權利要求5所述的tTIM融合蛋白疫苗的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述對生產的抗體進行OVA特異性鑒定的方法，包括：

1)ELISA微孔板用20μg/ml的OVA包被，加進抗OVA多克隆抗體孵育；微孔用BSA包被，作為非特異性對照抗原，統計檢驗方法為ANOVA；

2)用抗OVA的多克隆抗體包被ELISA微孔板，加梯度濃度的OVA-T細胞表位肽，按照ELISA的測試程序操作，統計檢驗方法為ANOVA。

7.一種應用如權利要求1～6任意一項所述的tTIM融合蛋白疫苗的制備方法制備得到的tTIM融合蛋白疫苗。

8.一種如權利要求7所述的tTIM融合蛋白疫苗在制備緩解過敏性疾病臨床癥狀的藥物中的應用。