[發明專利]提高威蘭膠表達的多酶復合體載體及高產威蘭膠的重組菌

有效

• 申請號: 202110047908.8
• 申請日: 2021-01-14
• 公開（公告）號: CN112725372B
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發明（設計）人: 李慧;朱虎;王繼乾;常愛平;黎可卉;姬思雪;郭中瑞;薛含
• 申請（專利權）人: 中國石油大學（華東）;福建師范大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12N15/52;C12P19/04;C12R1/01
• 代理公司: 山東三邦知識產權代理事務所(普通合伙) 37308
• 代理人: 高洋;牛繼梅

本發明公開了一種提高威蘭膠表達的多酶復合體載體及高產威蘭膠的重組菌，屬于分子生物學技術領域。本發明提高威蘭膠表達的多酶復合體載體，是將DNA支架序列、TALE1?ugpG和TALE2?welB構建到pBBR1SMCS?BB質粒中獲得的；本發明的多酶復合體載體通過模擬底物溝道傳遞效應，提高威蘭膠的表達。將本發明成功構建的多酶復合體表達載體整合到威蘭膠菌株中，獲得的重組菌株發酵威蘭膠的產量較野生菌株顯著提高，為威蘭膠的工業化生產奠定基礎。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種提高威蘭膠表達的多酶復合體載體及高產威蘭膠的重組菌。

背景技術

威蘭膠(Welan gum，曾編號S-130)又名威倫膠、韋蘭膠或沃倫膠，是由革蘭氏陰性鞘氨醇單胞菌合成的一種胞外雜多糖，分子量可以高達數百萬，它是美國KELCO公司開發的繼黃原膠和結冷膠之后，目前最具有市場應用前景的微生物多糖之一。

威蘭膠的主鏈主要由D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖按順序組成的四糖重復單元構成，其合成過程為多酶級聯反應。目前，國內關于威蘭膠的研究工作主要為威蘭膠菌種選育、搖瓶培養基優化、威蘭膠流變學性質及其影響因素等方面，其生產方法是鞘氨醇單胞菌屬利用天然的碳水化合物在細胞內發酵后分泌至胞外，天然微生物生產發酵產量較低，難以滿足人們對新型微生物多糖的需求。

生物合成胞外多糖的過程需要多種酶的參與，作用機制十分復雜。關于威蘭膠的具體合成途徑尚處于探索之中。根據前期的研究報道，鞘氨醇膠的合成基因具有較高的同源性，表明他們具有非常類似的合成機制。根據結冷膠的合成途徑推測威蘭膠具體的生物合成途徑發現，在威蘭膠的合成途徑中，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UgpG)將葡萄糖轉化為UDP-葡萄糖后，糖基轉移酶——葡萄糖磷酸異戊二烯轉移酶WelB接著將葡萄糖-1-磷酸從UDP-葡萄糖上轉移并整合到脂載體磷酸異戊二烯(IP)上，合成葡糖基-異戊二烯磷酸。UgpG催化形成的產物是WelB作用的底物，兩種酶催化的反應是天然的級聯酶促反應，在威蘭膠合成過程中有重要意義。

隨著人們對微生物多糖合成途徑及關鍵酶的不斷探索，通過微生物多糖的代謝工程來提高微生物多糖產量的方法取得了很大進展。但是僅通過改變代謝酶活性及提高代謝酶含量或敲除競爭途徑的方法并不一定能夠起到提高目標產物產量的目的，有時還會引起脅迫效應，反而降低目標產物產量。近年來，人們在細胞內代謝途徑中發現了許多天然的多酶復合體，通過底物溝道傳遞效應使代謝酶的催化效率大大提高。受底物溝道傳遞效應的啟發，人們試圖采取構建人工支架的方式，在空間上拉近級聯酶的距離，構建多酶復合體，模擬底物溝道傳遞效應，提高級聯酶的催化效率。但是傳統的人工支架如DNA支架、RNA支架和蛋白質支架由于自身的缺陷，限制了他們在體內的應用。

發明內容

針對現有技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種提高威蘭膠表達的多酶復合體載體及高產威蘭膠的重組菌。本發明利用TALE與DNA支架的特異性相互作用構建人工支架，將威蘭膠合成過程中的代謝酶進行空間組裝，構建多酶復合體，模擬底物溝道傳遞與加工機制，建立代謝酶空間組織工程的方法，構建威蘭膠高產菌株，為后續重組菌發酵生產威蘭膠奠定基礎。

為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種提高威蘭膠表達的多酶復合體支架，包括DNA支架序列、TALE1-UgpG和TALE2-WelB；

其中，所述DNA支架序列包含11個重復單元，每一個重復單元包括一個結合基序BM1和一個結合基序BM2；所述結合基序BM1和結合基序BM2之間有6bp的間隔序列；

所述結合基序BM1的核酸序列為：5’-CTGCCCTCCTGGTT-3’；

所述結合基序BM2的核酸序列為：5’-CCAGAAACAACACT-3’；

所述TALE1-UgpG的編碼序列如SEQ ID NO:12所示；