[發明專利]提高威蘭膠表達的多酶復合體載體及高產威蘭膠的重組菌

有效

• 申請號: 202110047908.8
• 申請日: 2021-01-14
• 公開（公告）號: CN112725372B
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發明（設計）人: 李慧;朱虎;王繼乾;常愛平;黎可卉;姬思雪;郭中瑞;薛含
• 申請（專利權）人: 中國石油大學（華東）;福建師范大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12N15/52;C12P19/04;C12R1/01
• 代理公司: 山東三邦知識產權代理事務所(普通合伙) 37308
• 代理人: 高洋;牛繼梅

1.一種提高威蘭膠表達的多酶復合體載體，其特征在于，將DNA支架序列、TALE1-ugpG和TALE2-welB構建到pBBR1SMCS-BB質粒中獲得的pBBR1SMCS-BB-T1U-T2B-DS即為提高威蘭膠表達的多酶復合體載體；

其中，所述DNA支架序列包含11個重復單元，每一個重復單元包括一個結合基序BM1和一個結合基序BM2；所述結合基序BM1和結合基序BM2之間有6bp的間隔序列；

所述結合基序BM1的核酸序列為：5’-CTGCCCTCCTGGTT-3’；

所述結合基序BM2的核酸序列為：5’-CCAGAAACAACACT-3’，

所述TALE1-ugpG的核酸序列如SEQ ID NO:12所示；

所述TALE2-welB的核酸序列如SEQ ID NO:13所示；

所述pBBR1SMCS-BB質粒是由pBBR1MCS-3質粒消除自帶的酶切位點Spe I和Xba I后，再在Lac啟動子上游和終止子下游分別引入Afl II、Spe I和Xba I、Bgl II兩組酶切位點改造成的質粒；

所述pBBR1SMCS-BB質粒的構建方法為：

①使用限制酶Spe I、Xba I對質粒pBBR1MCS-3進行雙酶切，將雙酶切后的質粒進行自連，得到形成新的scar序列的質粒pBBR1SMCS；

②以pBBR1SMCS質粒為模板，利用PCR分別擴增pBBR1SMCS質粒基因表達區和質粒除表達區外的主體部分，在PCR過程中通過引物分別在pBBR1SMCS質粒Lac啟動子上游和終止子下游引入酶切位點Afl II、Spe I和Xba I、Bgl II兩組酶切位點；

③利用In-fusion cloning方法將步驟②PCR獲得的兩個片段進行連接，獲得改造質粒pBBR1SMCS-BB。

2.根據權利要求1所述提高威蘭膠表達的多酶復合體載體，其特征在于，

所述pBBR1SMCS質粒基因表達區的擴增引物對為：

SFFor：5’-CTTAAGCCTAGGACTAGTGCGCAACGCAATTAATGTGA-3’；

SFRev：5’-AGATCTACGCGTTCTAGATCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGC-3’；

所述pBBR1SMCS質粒除表達區外的主體部分的擴增引物對為：

LFFor：5’-TCTAGAACGCGTAGATCTCTGCGATGAGTGGCAGGGCGG-3’；

LFRev：5’-ACTAGTCCTAGGCTTAAGTCACTGCCCGCTTTCCA-3’。

3.權利要求2所述的多酶復合體載體在威蘭膠表達中的應用。

4.一種高產威蘭膠的重組菌，其特征在于，將權利要求1所述的多酶復合體載體整合到威蘭膠生產菌鞘氨醇單胞菌中。

5.權利要求4所述高產威蘭膠重組菌的構建方法，其特征在于，采用三親雜交法將權利要求1所述的多酶復合體載體整合到威蘭膠生產菌鞘氨醇單胞菌中，具體是以鞘氨醇單胞菌作為受體菌；攜帶權利要求1所述的多酶復合體載體的E.coli作為供體菌；攜帶pRK2013的E.coli作為輔助菌；三者按比例混合培養使pBBR1SMCS-BB-T1U-T2B-DS整合到鞘氨醇單胞菌中。

6.根據權利要求5所述高產威蘭膠重組菌的構建方法，其特征在于，所述受體菌為鞘氨醇單胞菌Sphingomonas sp.WG，保藏號為：CCTCC No:M2013161。

7.使用權利要求6所述高產威蘭膠的重組菌發酵生產威蘭膠的方法，其特征在于，步驟為：

(1)將活化后的重組菌接種到種子培養基中，28℃、150rpm培養16h至對數期，獲得種子液；

(2)將種子液按照5％(v/v)的接種量接種至發酵培養基中，32.5℃、200rpm、發酵72h。

8.根據權利要求7所述高產威蘭膠的重組菌發酵生產威蘭膠的方法，其特征在于，

所述種子培養基為葡萄糖10g，酵母粉1g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂0.1g，去離子水定容至1L；

所述發酵培養基為葡萄糖67.37g、酵母粉3.42g、K₂HPO₄ 3.89g、MgSO₄ 0.1g、ZnSO₄0.1g、CaSO₄ 0.2g，1M NaOH調節pH至7，去離子水定容至1L。