[發明專利]一種負載去甲斑蝥素外泌體的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 202110047065.1
• 申請日: 2021-01-13
• 公開（公告）號: CN112773775B
• 公開（公告）日: 2022-12-20
• 發明（設計）人: 王嬰;王巖;梁樂誼;趙玲;郭密密
• 申請（專利權）人: 廣東藥科大學
• 主分類號: A61K9/50
• 分類號: A61K9/50;A61K31/365;A61K47/46;A61K35/00
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 王洋

1.一種負載去甲斑蝥素外泌體，其特征在于，所述負載去甲斑蝥素外泌體包括骨髓間充質干細胞外泌體及包裹在骨髓間充質干細胞外泌體內的去甲斑蝥素；

將所述去甲斑蝥素包裹在骨髓間充質干細胞外泌體內的方法是電穿孔法；

所述的電穿孔法包括以下步驟：

(1)將含有所述去甲斑蝥素和所述骨髓間充質干細胞外泌體的PBS溶液混合；

(2)對上述PBS溶液進行電刺激，得到電轉混合溶液；

(3)將電轉混合溶液孵育，得負載去甲斑蝥素外泌體；

步驟(2)中所述電刺激電壓為0.50-0.70mv；每隔25-35s電擊一次，共電擊6-10次。

2.根據權利要求1所述的負載去甲斑蝥素外泌體，其特征在于，步驟(3)中所述孵育溫度為35-38℃，孵育時間為25-35min。

3.根據權利要求1所述的負載去甲斑蝥素外泌體，其特征在于，步驟(3)中所述混合溶液經孵育后，超濾，得負載去甲斑蝥素外泌體。

4.根據權利要求1所述的負載去甲斑蝥素外泌體，其特征在于，步驟(1)中所述骨髓間充質干細胞外泌體與去甲斑蝥素的質量比為1:0.5-2。

5.一種根據權利要求1-4任意一項所述的負載去甲斑蝥素外泌體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)采用超速離心法提取骨髓間充質干細胞外泌體；

(2)通過電穿孔法將去甲斑蝥素包裹在所述外泌體內，得負載去甲斑蝥素外泌體。

6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述超速離心法提取外泌體的步驟為：

(1)將骨髓間充質干細胞擴培，待細胞密度為80-90％時，棄掉原含有血清的培養液，用PBS洗2-3次，加入DMEM，饑餓培養45-50h，收集含有外泌體的DMEM；

(2)將上述含有骨髓間充質干細胞外泌體的DMEM離心，得外泌體上清液；

(3)將上述外泌體上清液超速離心，取沉淀，加PBS重懸得純化外泌體。

7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述離心的次數為3次，其離心具體步驟為：離心溫度為2-6℃；第一次200-400g離心5-20min，吸取上清液；第二次1000-3000g離心10-20min，取上清液；第三次8000-12000g離心10-40min，得外泌體上清液。

8.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述離心為80000-120000g離心60-80min，取出超速離心管，取沉淀。

9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述離心還包括第二次離心，于80000-120000g離心60-80min，取沉淀。

10.根據權利要求9所述的制備方法，其特征在于，離心的溫度為2-6℃。

11.一種根據權利要求1-4任意一項所述的負載去甲斑蝥素外泌體或權利要求5-10任意一項所述方法制備的負載去甲斑蝥素外泌體在制備治療肝癌藥物中的應用。