[發明專利]一種可溶性融合蛋白DT390-Cap及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 202110045755.3
• 申請日: 2021-01-14
• 公開（公告）號: CN112898435B
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發明（設計）人: 范闊海
• 申請（專利權）人: 山西農業大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/81;C12N15/62;A61K39/12;A61K39/385;A61P31/20;C12R1/84
• 代理公司: 太原科衛專利事務所(普通合伙) 14100
• 代理人: 朱源;楊文艷

本發明屬于生物技術制藥工業中基因工程領域，具體是一種可溶性融合蛋白DT390?Cap及其制備與應用；可溶性融合蛋白DT390?Cap，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；可溶性融合蛋白DT390?Cap，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示；本發明通過試驗證明：在使用或不使用ISA201佐劑的情況下，和單獨免疫接種Cap相比，融合蛋白DT390?Cap免疫接種小鼠后誘導產生的抗Cap特異性抗體顯著升高，且能有效抑制PCV2在小鼠肺、肝和胸腺中的增值。采用融合表達的方式，DT390能增強Cap的免疫原性和免疫效果，并為后繼其他基因工程亞單位疫苗的研發提供一種新的設計模式。

技術領域

本發明屬于生物技術制藥工業中基因工程領域，具體是一種可溶性融合蛋白DT390-Cap及其制備與應用。

背景技術

豬圓環病毒相關疾病（Porcine circovirus-associated diseases，PCVAD）目前仍是對養豬業造成嚴重危害的疾病之一。豬圓環病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是PCVAD的主要病原體。PCV2基因組包含兩個主要的開放閱讀框（Open readingframe，ORF），其中ORF2編碼的衣殼蛋白（Cap）是主要結構蛋白，具有良好的免疫原性，能刺激動物機體產生針對PCV2的特異性免疫應答，是研發新型亞單位疫苗的主要靶蛋白。基于Cap研發的PCV2亞單位疫苗包括細菌載體疫苗，桿狀病毒載體疫苗，酵母載體疫苗，活載體表達疫苗和DNA疫苗。相關的研究表明，PCV2亞單位疫苗對來自不同地區、不同基因型的PCV2感染具有良好的免疫保護力，既能誘導免疫仔豬產生針對PCV2的特異性體液免疫應答，又能誘導產生細胞免疫應答，能顯著減輕病毒血癥，減少鼻腔和排泄物中PCV2 的排出量，降低各組織器官中PCV2的病毒載量。然而，免疫原性低仍然是Cap亞單位疫苗的主要問題。

白喉毒素（Diphtheria toxin，DT）是由感染β噬菌體的白喉棒狀桿菌（Corynebacterium diphtheriae）所產生的外毒素，分子大小為58.4 kDa，主要由三個彼此獨立的結構域組成，從N端到C端依次為催化區（C區），跨膜轉運區（T區）和細胞膜受體結合區（R區）。CRM197（Cross-reacting materials 197）是白喉毒素的一種無毒突變體，具有良好的安全性，其作為抗原的載體蛋白在疫苗的研發中得到了廣泛應用。白喉毒素截短片段DT390是白喉毒素N端1-390個氨基酸，包括催化區和跨膜轉運區。根據前期的研究發現，DT390與其他蛋白融合表達時，能夠增強其他蛋白的免疫原性。

發明內容

本發明利用DT390和Cap的優點，提供了一種融合蛋白DT390-Cap的制備與應用；將DT390和Cap基因進行優化后串聯，利用巴斯德畢赤酵母表達系統表達了DT390-Cap融合蛋白，通過免疫接種試驗和攻毒保護試驗評價了DT390-Cap的免疫原性和免疫效果。

為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案為：一種可溶性融合蛋白DT390-Cap，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述可溶性融合蛋白DT390-Cap，在制備豬圓環病毒2型疫苗中的應用。

所述 DT390蛋白在制備基因工程亞單位疫苗中的應用。

本發明進一步提供了一種可溶性融合蛋白DT390-Cap的制備方法，包括以下步驟：

pwPICZalpha-DT390-Cap表達載體的構建：以pwPICZalpha-Cap作為模板，使用帶有XhoI和NcoI位點的上游引物和帶有EcoRI位點的下游引物進行PCR擴增；擴增產物進行XhoI和EcoRI雙酶切后克隆到pwPICZalpha用于測序；經測序正確的擴增產物經NcoI和EcoRI雙酶切后，克隆到含有DT390的pwPICZalpha-DT390中，構建得到pwPICZalpha-DT390-Cap；