[發(fā)明專利]一種基于切離酶基因編輯技術(shù)的定向修復(fù)系統(tǒng)

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110045123.7
• 申請日: 2021-01-13
• 公開（公告）號: CN112626070A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 萬逸;戴睿
• 申請（專利權(quán)）人: 海南微氪生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N9/22;C12N15/63
• 代理公司: 海口翔翔專利事務(wù)有限公司 46001
• 代理人: 莫臻

本申請公開一種基于切離酶基因編輯技術(shù)的定向修復(fù)系統(tǒng)，其利用核酸酶失活的Cas9結(jié)構(gòu)域和指導(dǎo)RNA來定向基因位點(diǎn)，再利用切離酶來刪除靶向目的基因的基因靶點(diǎn)進(jìn)行定向修復(fù)，能夠避免隨機(jī)修復(fù)，為長距離定向基因刪除提供了特異性定向修復(fù)能力。用以解決現(xiàn)有的CRISPR/Cas9酶切技術(shù)進(jìn)行定向的基因編輯，CRISPR/Cas9酶切技術(shù)只能敲除靶向目的基因位點(diǎn)基因序列切割，如果去除基因組中的長片段，單獨(dú)CRISPR/Cas9技術(shù)是無法實(shí)現(xiàn)，需要設(shè)計(jì)兩個(gè)指導(dǎo)RNA序列；而且CRISPR/Cas9技術(shù)切除基因片段之后，其修復(fù)只能依賴于細(xì)胞內(nèi)的隨機(jī)修復(fù)系統(tǒng)的技術(shù)問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請涉及生物基因技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于切離酶基因編輯技術(shù)的定向修復(fù)系統(tǒng)。

背景技術(shù)

基因編輯技術(shù)指能夠讓微生物、動物和人類的細(xì)胞目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對靶點(diǎn)DNA片段的敲除和加入等的一項(xiàng)技術(shù)。自CRISPR/Cas9技術(shù)自問世以來，就有著其它基因編輯技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢，技術(shù)不斷改進(jìn)后，更被認(rèn)為能夠在活細(xì)胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。如果想使某個(gè)基因的功能喪失，可以在這個(gè)基因上產(chǎn)生位點(diǎn)切割，非同源末端連接修復(fù)的過程中往往會產(chǎn)生DNA的插入或刪除，造成移碼突變，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除。

切除酶(又稱切除酶；切割酶或切離酶)是由XIS基因編碼的噬菌體蛋白，可以切除噬菌體插入細(xì)菌基因組的基因。采用了一種不尋常的翼狀螺旋結(jié)構(gòu)，其中兩個(gè)α螺旋被包裝在兩個(gè)延伸的鏈上。結(jié)構(gòu)中還存在一個(gè)雙鏈反平行β-折疊片，其股線通過四殘余翼連接。在與DNA相互作用期間，螺旋α被認(rèn)為插入主溝中，而翼接觸相鄰的小溝或磷酸二酯骨干。切除酶的C末端區(qū)域參與與噬菌體編碼的整合酶的相互作用。

現(xiàn)有CRISPR/Cas9酶切技術(shù)進(jìn)行定向的基因編輯，CRISPR/Cas9酶切技術(shù)只能敲除靶向目的基因位點(diǎn)基因序列切割，如果去除基因組中的長片段，單獨(dú)CRISPR/Cas9技術(shù)是無法實(shí)現(xiàn)，需要設(shè)計(jì)兩個(gè)指導(dǎo)RNA序列；而且CRISPR/Cas9技術(shù)切除基因片段之后，其修復(fù)是依賴于細(xì)胞內(nèi)的隨機(jī)修復(fù)系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容

本申請實(shí)施例提供了一種基于切離酶基因編輯技術(shù)的定向修復(fù)系統(tǒng)，用以解決現(xiàn)有的CRISPR/Cas9酶切技術(shù)進(jìn)行定向的基因編輯，CRISPR/Cas9酶切技術(shù)只能敲除靶向目的基因位點(diǎn)基因序列切割，如果去除基因組中的長片段，單獨(dú)CRISPR/Cas9技術(shù)是無法實(shí)現(xiàn)，需要設(shè)計(jì)兩個(gè)指導(dǎo)RNA序列；而且CRISPR/Cas9技術(shù)切除基因片段之后，其修復(fù)是依賴于細(xì)胞內(nèi)的隨機(jī)修復(fù)系統(tǒng)的技術(shù)問題。

有鑒于此，本申請?zhí)峁┝艘环N基于切離酶基因編輯技術(shù)的定向修復(fù)系統(tǒng)，所述基因編輯定向修復(fù)系統(tǒng)建立在質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，包括質(zhì)粒載體；

所述質(zhì)粒載體包括：編輯器和指導(dǎo)RNA，所述編輯器與所述指導(dǎo)RNA為非共價(jià)結(jié)合；

所述編輯器包括用于定向的核酸酶失活的Cas9結(jié)構(gòu)域和XIS切離酶復(fù)合體；

所述指導(dǎo)RNA包含編碼靶向區(qū)域的crRNA和特異性靶向基因；

所述核酸酶失活的Cas9結(jié)構(gòu)域用于與所述指導(dǎo)RNA定向結(jié)合定位特異性位點(diǎn)，所述XIS切離酶復(fù)合體用于定向切除特異性靶向基因片段。