[發明專利]一種人誘導多能干細胞庫的構建方法

在審

• 申請號: 202110045048.4
• 申請日: 2021-01-13
• 公開（公告）號: CN113025654A
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 馬雋;崔慧先;郭瑞云;馮寶峰;劉鑫;孔德勝;何晶晶;杜曉峰;劉博鑫;馬振環
• 申請（專利權）人: 河北醫科大學;河北多能干細胞生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;C12N5/10;A01N1/02
• 代理公司: 昆明合盛知識產權代理事務所(普通合伙) 53210
• 代理人: 龍燕

本發明公開一種人誘導多能干細胞庫的構建方法，屬于誘導多能干細胞的制備技術領域。本發明所述方法通過重編程皮膚成纖維細胞建立誘導多能干細胞，誘導多能干細胞的傳代、凍存；建立誘導多能干細胞的數據庫。本發明所述方法通能夠在短時間內快速高效的將皮膚成纖維細胞重編程為誘導多能干細胞，避免了外源基因的加入，又能夠保證細胞活力和增殖能力，傳代穩定，并且高表達干細胞特異性蛋白，具有良好的多向分化能力，可長期存儲。使用了無血清培養基以及血清替代物配制凍存液，避免非人源物質對細胞表面標記以及純度的影響，對后期供者來源的干細胞以及干細胞制劑的使用提供安全無毒性的種子細胞。

技術領域

本發明涉及一種人誘導多能干細胞庫的構建方法，屬于誘導多能干細胞的制 備技術領域。

背景技術

誘導多能干細胞(Induce Pluripotent Stem Cells,iPSC)最初是日本科學家Yamanaka于2006年利用病毒載體將4個轉錄因子OSKM(Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc)組合轉入已經分化的體細胞中，使其重編程而得到的類似胚胎干細胞的 一種細胞類型；iPSC具有增值能力和多項分化能力，且由于其可來自供者的體 細胞，所以在臨床應用時不會引起免疫排斥作用，又能夠避開胚胎干細胞所帶來 的醫學倫理學問題，因此在疾病建模、藥物發現以及細胞療法等各方面都發揮重 要作用，促進了細胞生物學和再生醫學等學科的發展。

但是目前誘導多能干細胞的重編程體系有很多，例如整合病毒載體轉移系統 的重編程方法，但是一些報道指出，此方法由于外源基因的整合，病毒轉基因的 重新激活及其在產生i PSCs中的殘留活性會改變細胞的發育過程，并可能導致 嵌合動物腫瘤的形成，對于后期干細胞以及干細胞制劑有極大的限制。整合非病 毒性載體重編程效率極低，對于臨床樣本獲取困難以及一些難治性疾病的樣本的 要求極高，無法對少量的體細胞進行重編程。

發明內容

鑒于上述現有技術的不足，本發明要解決的技術問題是：采用現有技術重編 程產生的誘導多能干細胞效率低下、轉錄因子整合影響細胞正常基因組及核型、 細胞活性差易自主分化，以及含有外源成分的問題。

本發明的目的在于提供一種重編程建立誘導多能干細胞的培養方法，通過制 備、純化、擴增、鑒定與凍存過程，以更加安全、高效的方式完成對人誘導多能 干細胞庫的構建；該方法能夠在短時間內快速高效的將皮膚成纖維細胞重編程為 誘導多能干細胞，又能夠保證細胞活力和增殖能力，傳代穩定，并且高表達干細 胞特異性蛋白，具有良好的多向分化能力，可長期存儲。

本發明通過以下技術方案實現：一種人誘導多能干細胞庫的構建方法，具體 包括以下步驟：

(1)重編程皮膚成纖維細胞建立誘導多能干細胞，其中，重編程體系為非 整合型病毒體系，所選重編程病毒為仙臺病毒，所含轉錄因子為c-Myc，SeV， KOS，Klf4。

(2)誘導多能干細胞的傳代、凍存。

(3)建立誘導多能干細胞的數據庫：數據庫中包括六項資料：細胞活性檢 測結果、細胞感染的檢測結果、遺傳病的檢測結果、細胞致癌性的檢測結果、 HLA-ABC/DR配型結果、細胞來源，并建立與凍存細胞的關聯。

優選的，本發明所述重編程皮膚成纖維細胞建立誘導多能干細胞，具體包括 以下步驟：

①收集皮膚組織，將取得的皮膚組織采用酶消化貼壁的方法分離出成纖維細 胞，并對成纖維細胞進行傳代、凍存以及進行相關鑒定；

②在實施病毒轉染的前兩天，將凍存的第三代成纖維細胞接種在六孔板的至 少兩個孔中，使轉導當天的細胞密度達到每個孔2×10⁵-3×10⁵；

③向預熱的成纖維細胞培養基中加入非整合型病毒載體，將培養基加入成纖 維細胞中，之后細胞在條件為37℃，5％CO₂的培養箱中孵育過夜；