[發明專利]一種人誘導多能干細胞庫的構建方法

在審

• 申請號: 202110045048.4
• 申請日: 2021-01-13
• 公開（公告）號: CN113025654A
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 馬雋;崔慧先;郭瑞云;馮寶峰;劉鑫;孔德勝;何晶晶;杜曉峰;劉博鑫;馬振環
• 申請（專利權）人: 河北醫科大學;河北多能干細胞生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;C12N5/10;A01N1/02
• 代理公司: 昆明合盛知識產權代理事務所(普通合伙) 53210
• 代理人: 龍燕

1.一種人誘導多能干細胞庫的構建方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

(1)重編程皮膚成纖維細胞建立誘導多能干細胞，其中，重編程體系為非整合型病毒體系，所選重編程病毒為仙臺病毒，所含轉錄因子為c-Myc、SeV、KOS、Klf4；

(2)誘導多能干細胞的傳代、凍存；

(3)建立誘導多能干細胞的數據庫：數據庫中包括六項資料：細胞活性檢測結果、細胞感染的檢測結果、遺傳病的檢測結果、細胞致癌性的檢測結果、HLA-ABC/DR配型結果、細胞來源，并建立與凍存細胞的關聯。

2.根據權利要求1所述人誘導多能干細胞庫的構建方法，其特征在于：所述重編程皮膚成纖維細胞建立誘導多能干細胞，具體包括以下步驟：

①收集皮膚組織，將取得的皮膚組織采用酶消化貼壁的方法分離出成纖維細胞，并對成纖維細胞進行傳代、凍存以及進行相關鑒定；

②在實施病毒轉染的前兩天，將凍存的第三代成纖維細胞接種在六孔板的至少兩個孔中，使轉導當天的細胞密度達到每個孔2×10⁵-3×10⁵；

③向預熱的成纖維細胞培養基中加入非整合型病毒載體，將培養基加入成纖維細胞中，之后細胞在條件為37℃，5％CO₂的培養箱中孵育過夜；

④病毒因子轉入24h后，更換培養基以移去病毒，之后用成纖維細胞培養基繼續培養細胞6天，隔日換液；

⑤第7天，用1ml稀釋好的Geltrex Membrane Mtrix或Matrigel Matrix 37℃包被六孔板1h；

⑥用0.5ml 0.05％-0.25％EDTA胰蛋白酶消化離心收集細胞，并根據每孔5×10⁴-10×10⁴密度將細胞接種在基質包被的六孔板上；加入成纖維細胞培養基，37℃，5％的CO₂培養箱中孵育過夜；

⑦24小時之后，將成纖維培養基換更成Essential 8完全培養基，每天換液一次；從第8天開始，每隔一天在顯微鏡下觀察誘導多能干細胞克隆的出現；

⑧通常在第12天觀察到克隆形成，3-4周后克隆長到合適的大小，手動挑選未分化的干細胞克隆，記為第一代(P1)，并轉移到采用Geltrex Membrane Mtrix(Gibco)包被的培養皿上以進一步擴增。

3.根據權利要求2所述人誘導多能干細胞庫的構建方法，其特征在于：步驟③中成纖維細胞培養基為：DMEM基礎培養基+10％胎牛血清+1％NEAA+1％雙抗。

4.根據權利要求1所述人誘導多能干細胞庫的構建方法，其特征在于：誘導多能干細胞的傳代：待細胞融合度達到80％-90％時，使用消化液Gentle Cell Dissociation Reagent0.5ml，37℃消化5-8min，顯微鏡下觀察細胞克隆逐漸解離，細胞連接逐漸疏松，移去消化液，加入0.5ml PBS輕輕清洗殘余消化液后移去PBS，加入Essential 8完全培養基，輕輕晃動培養皿，細胞克隆從培養皿底部脫落為5-10個細胞團塊的克隆，將其轉移到新的六孔板中，加入2ml Essential 8完全培養基繼續培養。

5.根據權利要求4所述人誘導多能干細胞庫的構建方法，其特征在于：誘導多能干細胞培養過程使用的無血清培養基為Essential 8^TM Medium或StemFlex ^TM Medium。

6.根據權利要求1所述人誘導多能干細胞庫的構建方法，其特征在于：誘導多能干細胞的凍存：在傳代細胞融合度至80％-90％時，使用Gentle Cell Dissociation Reagent0.5ml，37℃消化5-8min，顯微鏡下觀察細胞克隆逐漸解離，細胞連接逐漸疏松，移去消化液，加入0.5ml PBS輕輕清洗殘余消化液后移去PBS，向其中加入1ml凍存液，凍存液由KnockOutTM Serum Replacement+10％DMSO配成；輕輕晃動培養皿，收集細胞于1.8ml凍存管中，放入程序性凍存盒中，置于-80℃冰箱內；24小時后，將細胞由-80℃轉移至液氮中保存。