[發明專利]體外培育熊膽粉中異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的測定方法

有效

• 申請號: 202110045042.7
• 申請日: 2021-01-13
• 公開（公告）號: CN112903836B
• 公開（公告）日: 2023-03-24
• 發明（設計）人: 季申;胡青;毛秀紅;孫健;周恒;馮睿;張小利
• 申請（專利權）人: 上海凱寶藥業股份有限公司;上海市食品藥品檢驗研究院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/86
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 郎祺

本發明提供了體外培育熊膽粉中異丙基?β?D?硫代吡喃半乳糖苷的測定方法，包括如下步驟：稱取體外培育熊膽粉樣品按照50?200mg/5ml的比例置于水中，然后振蕩8?15分鐘至樣品完全溶解；將上述處理得到的溶液上樣于活化的親水親脂平衡固相萃取柱，沖洗，洗脫，收集洗脫液，濾過，取續濾液，得到供試品溶液；將上述供試品溶液注入液相色譜?質譜儀進行檢測。本發明提供的測定方法通過對凈化、檢測步驟中的條件以及參數進行了調整和優化，具有中間精密度良好、準確度高、重復性良好的優點，此外，以稀釋10倍的濃度作為該方法檢出限，方法檢出限為0.68mg/kg，因此為體外培育熊膽粉中IPTG殘留量的檢測提供了可靠易操作的方法，促進了對體外培育熊膽粉的安全性把控。

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，尤其涉及體外培育熊膽粉中異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的測定方法。

背景技術

熊膽，由熊科動物黑熊或棕熊干燥膽囊膽汁得到，具有清熱、平肝、明目的功效。熊膽是四大名貴動物藥之一，有2000余年的入藥歷史，有大量的處方都含有熊膽成分。我國每年熊膽粉產量約30噸，仍然滿足不了人類健康的需求。目前高端熊膽粉供需矛盾的日益突出和低端原料用熊膽粉市場需求的持續增加，使得熊膽粉的價格節節攀升，市場價格已經超過了5000元/kg。更為嚴峻的是，國內外動物保護組織對活熊取膽的長期抵制，給國內熊膽粉的生產和相關產業的發展帶來了前所未有的阻力。因此，加快人工熊膽的研發是促進熊膽產業可持續發展的關鍵。申請號為201410588581.5的現有專利公開了一種人工熊膽粉及其制備方法，具體生產了一種體外培育(生物轉化)熊膽粉，其以禽類膽粉為原料，通過體外模擬膽汁酸肝腸循環，采用兩步酶促法與雙酶聯用循環轉化技術對禽膽粉進行生物轉化獲得，其原料來源廣泛易得，不需要再添加其他化學物質，可以促進熊膽產業健康發展。

但上述體外培育熊膽粉制備過程所需的關鍵酶菌體--A酶菌體和B酶菌體是通過7α-HSDH和7β-HSDH兩個重組質粒轉化到宿主菌E.coli BL21(DE3)中，經抗性篩選并通過多級培養后獲得的。IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)是A酶菌體/B酶菌體誘導外源基因表達的誘導劑。為加強對體外培育(生物轉化)熊膽粉的安全性把控，需對發酵過程中的主要添加物，特別是IPTG進行含量限度檢查，但目前未有檢測體外培育熊膽粉中IPTG殘留量的方法。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供了體外培育熊膽粉中異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的測定方法。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

本發明提供了體外培育熊膽粉中異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的測定方法，包括如下步驟：

步驟一，溶解樣品：稱取體外培育熊膽粉樣品按照50-200mg/5ml的比例置于水中，然后振蕩8-15分鐘至樣品完全溶解；

步驟二，凈化處理：將步驟一處理得到的溶液上樣于活化的親水親脂平衡固相萃取柱，沖洗，洗脫，收集洗脫液，濾過，取續濾液，得到供試品溶液；

步驟三，將上述供試品溶液注入液相色譜-質譜儀進行檢測。

進一步地，上述固相萃取柱為親水親脂平衡固相萃取柱或強陰離子交換反相吸附填料固相萃取柱。

進一步優選地，上述固相萃取柱為Waters Oasis HLB固相萃取柱，其規格為500mg/6cc。

進一步地，步驟二中依次采用甲醇和水對上述親水親脂平衡固相萃取柱進行活化；甲醇和水的體積比為1:1。

進一步地，步驟二中采用水進行沖洗，采用甲醇溶液進行洗脫。

進一步優選地，步驟二中采用20％的甲醇溶液進行洗脫兩次。

進一步地，步驟三中檢測采用Waters CORTECS T3色譜柱，其規格為100mm×2.1mm，2.7μm。