[發(fā)明專利]高活性β-半乳糖苷酶的制備

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110044959.5
• 申請日: 2021-01-13
• 公開（公告）號: CN112608914A
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬金佑
• 申請（專利權(quán)）人: 馬金佑
• 主分類號: C12N9/38
• 分類號: C12N9/38;C12N15/56;C12N15/10;C12N15/70;C12N15/66;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.高活性β-半乳糖苷酶的制備，其特征在于，所述酶基因序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)在第1983位，由原來的A分別突變?yōu)門，構(gòu)建方法包括以下步驟：

1)從NCBI上獲得β-半乳糖苷酶序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)，交生物公司合成，設(shè)計(jì)PCR引物F：5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，PCR反應(yīng)結(jié)束后，加20μlCloning Enhancer到PCR體系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ酶切pET20b(+)質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)過0.75％瓊脂糖凝膠電泳后回收，溶于滅菌雙蒸水中，將孵育后的PCR產(chǎn)物與純化的線性載體混合均勻，加入In-Fusion酶，50℃反應(yīng)15min，轉(zhuǎn)化E.coliJM109，挑取陽性克隆，送生物公司測序，將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主E.coli BL21進(jìn)行表達(dá)，得到含有野生型序列質(zhì)粒的基因工程菌；

2)質(zhì)粒DNA的提取

將攜帶有質(zhì)粒pET20b(+)/β-galactosidase的E.coli BL21基因工程菌接種于LB/Am p(Amp終濃度100μg/mL)液體培養(yǎng)基中，于37℃，200r/min過夜培養(yǎng)后，使用質(zhì)粒小量提取試劑盒抽提質(zhì)粒，具體操作按照說明書進(jìn)行；

3)易錯(cuò)PCR擴(kuò)增與突變文庫的構(gòu)建

以步驟2獲得的質(zhì)粒為模板，用Not Ⅰ酶切使質(zhì)粒線性化，用引物序列5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTCGCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAATATGATTAACT-3'，進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增基因，易錯(cuò)PCR擴(kuò)增體系(50μl)為10×TaKaRa TaqBuffer，dNTPs Mixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA 200ng，Taq DNA聚合酶2.5U，5mmol/LMn²⁺，0.5U/μl的Taq DNA聚合酶2.5μl，7mmol/L的Mg²⁺,PCR反應(yīng)條件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35個(gè)循環(huán)，72℃10min，加20μl Cloning Enhancer到PCR體系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，將pET20b(+)質(zhì)粒用EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ酶切線性化，酶切產(chǎn)物經(jīng)過0.75％瓊脂糖凝膠電泳后回收，溶于滅菌雙蒸水中，將孵育后的PCR產(chǎn)物與純化的線性載體混合均勻，加入In-Fusion酶，50℃反應(yīng)15min，轉(zhuǎn)化E.coli BL21；

4)突變文庫的高通量篩選

將步驟3得到的轉(zhuǎn)化E.coli BL21，37℃孵育1h后收集菌體涂布氨芐青霉素抗性培養(yǎng)基(100μg/mL)，37℃溫育12h，將平板上菌落分別刮取，接種至含100μg/mL氨芐青霉素的100mLLB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)14h后提取混合質(zhì)粒，混合質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ酶切后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，涂布MD平板，待MD平板上出現(xiàn)菌落后，將菌落挑至涂有X-gal的MM培養(yǎng)基上，使X-gal變藍(lán)的菌株即為陽性突變體，挑取陽性菌株接種于48孔培養(yǎng)板中，每孔加入YPD培養(yǎng)基500μL、2％接種量，于28℃、200r/min培養(yǎng)48h，離心收集菌體以500μL BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，28℃、200r/min培養(yǎng)48h，每12h補(bǔ)加甲醇至終濃度為0.5％，誘導(dǎo)結(jié)束后離心取上清即為粗酶液；

5)酶蛋白純化

配制AKTA使用的緩沖液，其中A液：20mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH7.5)，B液：1mol/L氯化鈉溶液(20mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH7.5)，以5倍柱床體積的A液平衡柱子后，粗酶液經(jīng)A液流入captorQ(1mL)陰離子柱中，通過B液進(jìn)行梯度洗脫：以5倍柱床體積的11％的B液洗脫雜蛋白，再以5％B液洗脫目的蛋白；

6)粗酶液中蛋白含量的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品，配置10mg/mL BSA母液，稀釋為以下幾個(gè)梯度：10.0mg/mL、8.0mg/mL、6.0mg/mL、4.0mg/mL、2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL，取不同濃度BSA溶液或超純水40μL，加入5倍稀釋后的Bio-Rad考馬斯亮藍(lán)蛋白染液260μL，震蕩混勻后室溫靜置15min，取200μL加入酶標(biāo)板中，于595nm下測定吸光度，記錄數(shù)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取粗酶液或純化后的酶液40μL，加入稀釋后染液260μL，混勻后室溫靜置15min，取200μL加入酶標(biāo)板中于595nm下測定吸光度，記錄數(shù)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶液的蛋白濃度；

7)酶活及比活力測定

配制不同濃度對硝基苯酚溶液(濃度分別為0.01mmol/L、0.02mmol/L、0.03mmol/L、0.04mmol/L、0.05mmol/L、0.06mmol/L、0.07mmol/L、0.08mmol/L、0.09mmol/L和0.1mmol/L)，定容至10ml，各取2ml，加入2ml 1mol/L Na₂CO₃溶液顯色，420nm波長下測定吸光度值，做對硝基苯酚-光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線；

將200μL稀釋的酶液加入到800μL2.5g/L經(jīng)預(yù)熱的ONPG(pH6.5，1mM磷酸鉀緩沖液)溶液中，在給定溫度下反應(yīng)10min，加入1mL 10％Na₂CO₃溶液終止反應(yīng)，于420nm測定吸光值，空白以滅活的酶液代替有活性酶液，假設(shè)標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝aX+b；

E:酶活，單位U/ml

t:反應(yīng)時(shí)間

N:酶液稀釋倍數(shù)

V₂：反應(yīng)終體積

V₁：酶液添加量

8)將比活最高的突變子，送生物公司測序。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活性β-半乳糖苷酶的應(yīng)用，其特征在于，所述的高活性β-半乳糖苷酶應(yīng)用于醫(yī)藥、乳制品、免疫分析檢測、化學(xué)合成、生物、環(huán)保領(lǐng)域。