[發(fā)明專利]ApoE基因缺失斑馬魚的制備

在審

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• 申請日: 2021-01-13
• 公開（公告）號(hào): CN112695034A
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪利平
• 申請（專利權(quán)）人: 汪利平
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N9/22;C12N15/89;A01K67/027;A01K61/10
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本發(fā)明利用CRISPR/Cas9技術(shù)，構(gòu)建成了ApoE基因缺失斑馬魚，具體步驟包括：1)根據(jù)ApoE基因序列，確定ApoE靶位點(diǎn)；2)制備gRNA；3)體外轉(zhuǎn)錄Cas9mRNA；4)將Cas9mRNA和gRNA混合，注射到單細(xì)胞期斑馬魚胚胎中；5)將F₀胚胎飼養(yǎng)至性成熟；6)與野生型成魚外交，篩選F₀；7)選取可產(chǎn)生有效突變的F₀自交，篩選F₁；8)從F₁代突變體中挑選相同突變的雌魚和雄魚，雜交得到F₂代；9)篩選ApoE基因敲除純合子即為穩(wěn)定遺傳的ApoE基因缺失斑馬魚。本發(fā)明構(gòu)建的ApoE基因缺失斑馬魚可穩(wěn)定遺傳，可用于阿爾茲海默癥、骨質(zhì)疏松、冠心病疾病的研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及ApoE基因缺失斑馬魚的制備。

背景技術(shù)

人的ApoE是一個(gè)由299個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，在多種器官中表達(dá)，表達(dá)量最高的是肝臟，其次是大腦。大腦中表達(dá)ApoE的細(xì)胞主要是一些非神經(jīng)元細(xì)胞，ApoE和Aβ相互作用，在阿爾茲海默癥發(fā)病中扮演了重要角色。在周邊和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元損傷后ApoE表達(dá)會(huì)大量增加，一些研究表明ApoE在維持神經(jīng)的可塑性和功能方面十分重要。近年來，國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為ApoE是骨質(zhì)疏松癥的候選基因之一，ApoE基因多樣性與骨量流失和骨質(zhì)疏松性具有相關(guān)性。ApoE基因多態(tài)性與冠心病發(fā)生有密切關(guān)系，ApoE基因變異對冠心病的危險(xiǎn)性有強(qiáng)烈而持續(xù)的影響。

斑馬魚性成熟時(shí)間短，出生后3個(gè)月就可以達(dá)到性成熟，繁殖能力強(qiáng)，飼養(yǎng)成本低，生命周期短，胚胎體外發(fā)育且透明，所需藥物少，非常適宜用于阿爾茲海默癥、骨質(zhì)疏松、冠心病的研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建一種ApoE基因缺失斑馬魚。

本發(fā)明的制備過程如下：

本發(fā)明靶位點(diǎn)DNA序列為：5’-GGATGGCGCCACCCAGAAAC-3’。

本發(fā)明提供一種基因打靶試劑盒，所述試劑盒包括兩條Oligo序列，其序列為5’-GGATGGCGCCACCCAGAAAC-3’，5’-AAACGTTTCTGGGTGGCGCCAT-3’，使用該試劑盒可以用于ApoE基因表達(dá)的沉默。

本發(fā)明提供了一種基因敲除方法，所述方法的步驟如下：利用所述的Oligo片段識(shí)別目的基因的靶位點(diǎn)，與Cas9結(jié)合并識(shí)別靶位點(diǎn)處PAM序列，引導(dǎo)核酸酶結(jié)合到目的基因靶位點(diǎn)處，并開始進(jìn)行剪切，形成DSB缺口，隨后細(xì)胞通過非同源末端連接修復(fù)機(jī)制修復(fù)目的基因雙鏈，造成移碼突變，最終目的基因被敲除。

進(jìn)一步的，所述靶點(diǎn)為一個(gè)或以上。

進(jìn)一步的，本發(fā)明提供ApoE基因缺失斑馬魚的制備方法，所述制備方法包括：

1.根據(jù)ApoE基因序列，確定ApoE靶位點(diǎn)；

2.根據(jù)ApoE靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)Oligo序列；

3.構(gòu)建gRNA體外轉(zhuǎn)錄載體；

4.PCR獲得gRNA體外轉(zhuǎn)錄模板；

5.對步驟4獲得的模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到gRNA；

6.制備Cas9 mRNA的體外轉(zhuǎn)錄模板；

7.體外轉(zhuǎn)錄Cas9 mRNA；

8.添加polyA序列、回收Cas9 mRNA；

9.將Cas9 mRNA和gRNA混合，注射到單細(xì)胞期斑馬魚胚胎中；

10.將F₀胚胎飼養(yǎng)至性成熟；