[發(fā)明專利]一種低溫活性改良的外切菊粉酶突變體MutDR121EH9

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110041629.0
• 申請日: 2021-01-13
• 公開（公告）號: CN112831485B
• 公開（公告）日: 2023-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張蕊;周峻沛;黃遵錫;岑瀟龍;許波;韓楠玉;唐湘華;李俊俊;吳倩;高艷秀
• 申請（專利權(quán)）人: 云南師范大學(xué)
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 劉妮

本發(fā)明公開了一種低溫活性改良的外切菊粉酶突變體MutDR121EH9，該突變體MutDR121EH9具有如SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列，其熱活性和熱穩(wěn)定性發(fā)生了改變，在低溫下具有更高的活性，而熱穩(wěn)定性降低，低溫活性變高有利于在低溫反應(yīng)時減少酶的用量或縮短反應(yīng)時間，熱穩(wěn)定性變差有利于通過熱處理控制酶的反應(yīng)過程。野生酶InuAMN8的最適溫度為35℃，突變酶MutDR121EH9的最適溫度為20℃；50℃處理后，野生酶InuAMN8保持81％以上的酶活性，突變酶MutDR121EH9的酶活從32％降至14％。本發(fā)明的突變體MutDR121EH9可應(yīng)用于食品、釀酒和洗滌等行業(yè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種外切菊粉酶突變體，具體涉及一種低溫活性改良的外切菊粉酶突變體MutDR121EH9。

背景技術(shù)

菊芋在我國的大部分地區(qū)都可以種植，是一種高密度的非糧能源作物，耐旱、耐貧瘠、耐鹽堿、產(chǎn)量高。菊芋塊莖的干物質(zhì)中，菊粉含量可高達70％，這些特點使菊芋的有效利用成為關(guān)注的焦點。

菊粉是由果糖聚合而成的多糖，經(jīng)外切菊粉酶水解，可得到糖含量高達95％的果糖漿。果糖廣泛用于食品、醫(yī)藥、生物能源等行業(yè)，可作為天然甜味劑替代蔗糖，可以供糖尿病患者食用，可作為原料用來生產(chǎn)生物乙醇等。因而，外切菊粉酶可應(yīng)用于食品、釀酒和生物能源等行業(yè)中(Singh?RS?et?al.International?Journal?ofBiologicalMacromolecules,2017,96:312–322)。

具有低溫活性的酶制劑可應(yīng)用于低溫生境和低溫加工過程，如清酒和葡萄酒的發(fā)酵溫度、水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境、洗滌、污水處理通常在25℃的低溫下進行。另外，低溫下的處理(如果汁澄清)可防止微生物的污染、營養(yǎng)損失和食品品質(zhì)降低，將中溫或者高溫處理方式轉(zhuǎn)為低溫處理方式還可起到降低能耗的作用(Cavicchioli?et?al.Microbial?Biotechnology,2011,4(4):449–460)。因此，提高酶在低溫下的催化活性將有利于酶在食品、釀酒和洗滌等行業(yè)中的應(yīng)用。

為了能方便有效地控制酶的催化反應(yīng)，需要容易熱變性的酶；同時，為了使酶的使用更具安全性，需要酶經(jīng)過簡單地處理后就容易降解，而熱變性使酶容易暴露蛋白酶酶切位點，導(dǎo)致酶容易被降解。因此，獲得容易熱變性的突變酶，將有利于酶在食品、釀酒和洗滌等行業(yè)中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種低溫活性改良的外切菊粉酶突變體MutDR121EH9，該突變酶MutDR121EH9在低溫下具有更高的活性，而熱穩(wěn)定性降低，低溫活性變高有利于在低溫反應(yīng)時減少酶的用量或縮短反應(yīng)時間。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種低溫活性改良的外切菊粉酶突變體MutDR121EH9，該突變體MutDR121EH9具有如SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列。與GenBank記錄的外切菊粉酶序列AGC01505(SEQ?ID?NO.3)相比，MutDR121EH9有一段序列與其不同，即AGC01505的第121位至128位氨基酸為DAAPLPGR，而MutDR121EH9的第121位至129位氨基酸為EEDRKTGLH。

本發(fā)明的突變體MutDR121EH9的最適溫度為20℃，在0℃、10℃、35℃、40℃和50℃時分別具有43％、55％、72％、38％和16％的酶活；45℃處理10–60min后，MutDR121EH9的酶活保持在80％左右；50℃處理10–60min后，MutDR121EH9的酶活從32％降至14％。

本發(fā)明的另一目的是提供所述的突變體MutDR121EH9的編碼基因mutDR121EH9。

優(yōu)選地，所述編碼基因mutDR121EH9具有如SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明的另一目的是提供包含所述的編碼基因mutDR121EH9的重組載體。