[發(fā)明專利]一種快速鑒定及定量樣本中粟酒裂殖酵母的方法

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• 申請日: 2021-01-12
• 公開（公告）號: CN112725496A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 杜海;徐巖;周天慈;孫佳
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12Q1/06;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

1.鑒定粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示。

2.應(yīng)用權(quán)利要求1所述引物鑒定粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的方法，其特征在于，包括步驟：將待測樣品制成菌懸液，將菌懸液稀釋涂布獲得單菌落，以SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3所示序列為引物進行菌落PCR，通過凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物，如果電泳圖譜上PCR產(chǎn)物在100-250bp之間有條帶，則說明樣品中含有粟酒裂殖酵母，如果PCR產(chǎn)物不在100～250bp之間或者沒有條帶時，說明樣品中沒有粟酒裂殖酵母。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述樣品為發(fā)酵食品成品或者取自發(fā)酵食品發(fā)酵過程中的樣品，包括大曲或酒醅。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述樣品中含有庫德里阿茲威畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、拜爾結(jié)合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、白色假絲酵母(Candida humilis)和巴氏哈薩克斯坦酵母(Kazachstania barnettii)。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，還對100-250bp之間的PCR產(chǎn)物進行測序，并將測序結(jié)果與粟酒裂殖酵母的乙醇脫氫酶編碼基因序列進行比對。

6.應(yīng)用權(quán)利要求1所述引物定量檢測粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的方法，其特征在于，包括步驟：

(1)配置不同菌濃的、已知濃度的粟酒裂殖酵母菌懸液，分別提取菌懸液中的基因組；

(2)利用SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示引物對基因組分別進行熒光定量PCR，以CT值為橫坐標，以細胞數(shù)量或細胞數(shù)量的Lg值為縱坐標，繪制標準曲線；

(3)提取待測樣品中的基因組，利用SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示引物對待測樣品的基因組進行熒光定量PCR，將熒光定量PCR的CT值代入標準曲線，換算得到樣品中的粟酒裂殖酵母的數(shù)量。

7.區(qū)分粟酒裂殖酵母與庫德里阿茲威畢赤酵母(Pichia kudriavzevii)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、拜爾結(jié)合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、白色假絲酵母(Candida humilis)、巴氏哈薩克斯坦酵母(Kazachstania barnettii)的方法，其特征在于，以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示序列為引物，進行菌落PCR或分別以上述酵母的基因組為模板進行PCR，通過凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物，如果電泳圖譜上PCR產(chǎn)物在100-250bp之間有條帶，則說明相應(yīng)菌株是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

8.用于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的定性、定量的檢測試劑盒，其特征在于，含有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示引物，還包括DNA聚合酶及緩沖液。

9.使用權(quán)利要求8所述試劑盒對粟酒裂殖酵母進行定性檢測的方法，其特征在于，包括：將待測樣品制成菌懸液，將菌懸液稀釋涂布獲得單菌落，以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示序列為引物進行菌落PCR，通過凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物，如果電泳圖譜上PCR產(chǎn)物在100-250bp之間有條帶，則說明樣品中含有粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

10.使用權(quán)利要求8所述試劑盒對粟酒裂殖酵母進行定量檢測的方法，其特征在于，包括：(1)配置不同菌濃的、已知濃度的粟酒裂殖酵母菌懸液，分別提取菌懸液中的基因組；(2)利用SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示引物對基因組分別進行熒光定量PCR，以CT值為橫坐標，以細胞數(shù)量或細胞數(shù)量的Lg值為縱坐標，繪制標準曲線；(3)提取待測樣品中的基因組，利用SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示引物對待測樣品的基因組進行熒光定量PCR，將熒光定量PCR的CT值代入標準曲線，換算得到樣品中的粟酒裂殖酵母的數(shù)量。