[發明專利]一種快速鑒定及定量樣本中粟酒裂殖酵母的方法

在審

• 申請號: 202110035837.X
• 申請日: 2021-01-12
• 公開（公告）號: CN112725496A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 杜海;徐巖;周天慈;孫佳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12Q1/06;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種快速鑒定及定量樣本中粟酒裂殖酵母的方法，屬于生物工程技術領域。本發明針對粟酒裂殖酵母乙醇脫氫酶基因Adh4設計了特異性引物SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3，可以通過PCR技術實現對大曲、酒醅等樣本中發酵體系中粟酒裂殖酵母的快速定性和定量檢測；準確性高、有效性好、靈敏性高。本發明技術方案適用發酵食品成品或者取自發酵食品發酵過程的樣品。

技術領域

本發明涉及一種快速鑒定及定量樣本中粟酒裂殖酵母的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

目前，中國大部分名優白酒都使用傳統的大曲法釀造。大曲是以大麥、小麥、豌豆等為原料，經過破碎、加水拌料、壓成磚塊狀的曲醅后，在人工控制的溫度、濕度下培養而成的。大曲中含有豐富的霉菌、酵母、細菌等微生物及它們產生的各種酶，是一種多菌種的混合粗酶制劑，其中，真菌的作用不容忽視。由于大曲中棲息著豐富的微生物，加曲不但使大量有益的釀酒微生物菌種直接轉移到發酵酒醅，而且還給酒醅提供了以淀粉酶、蛋白酶為主的各種酶類，同時，大曲還給酒醅帶來了數量可觀的、多種多樣的代謝產物，在賦予大曲酒更好的口味和香氣方面起著重要作用。

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)是裂殖屬的桿狀酵母，被廣泛應用于白酒釀造，是白酒釀造體系中的核心酵母，有較高的乙醇發酵能力，能夠降低影響產品質量安全的氨基甲酸乙酯的濃度，是極具釀酒潛力的非釀酒酵母。篩選、鑒定和分析粟酒裂殖酵母，對改善白酒品質具有重要意義。現有的鑒定粟酒裂殖酵母的方法，主要利用菌株的理化性質或ITS4，這種鑒定方法存在周期長、費用高、成功率低等問題。

乙醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase，簡稱ADH)是一類具有高度保守結構域的氧化還原酶，典型的乙醇脫氫酶是一種鋅結合酶，其結構域中有一個鋅結合結構域。該酶可充當二聚體，并依賴NAD(P)+輔助因子來可逆轉化乙醇和乙醛。乙醇脫氫酶的基本功能是在無氧呼吸時，在糖酵解的最后一步反應中，將乙醛轉化為乙醇。該反應可有效減輕無氧呼吸產生的代謝產物對細胞自身的毒害作用。除此以外，乙醇脫氫酶催化乙醛生成乙醇的過程也伴隨著能量分子ATP的生成。在NADH生成NAD⁺的過程中會伴隨生成一個H⁺，通過電子傳遞鏈，最終這個能量會轉化為ATP中的高能磷酸鍵中儲存的能量。當釀酒酵母在可發酵碳源如葡萄糖上生長時，乙醇醇脫氫酶被認為主要負責通過催化乙醛還原產生乙醇而從NADH中再生NAD⁺。此外，不同的酵母編碼乙醇脫氫酶的基因序列是不同的。

發明內容

[技術問題]

本發明要解決的技術問題是現有的鑒定粟酒裂殖酵母的方法，主要利用菌株的理化性質或ITS4，這種鑒定方法存在周期長、費用高、成功率低等問題。

[技術方案]

本發明提供用于鑒定粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的引物，其序列如SEQ ID NO：2(引物Adh4F)、SEQ ID NO：3(引物Adh4R)所示。

本發明還提供應用所述引物鑒定粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的方法，包括步驟：將待測樣品制成菌懸液，將菌懸液稀釋涂布獲得單菌落，以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示序列為引物進行菌落PCR，通過凝膠電泳觀察PCR產物，如果電泳圖譜上PCR產物在100-250bp之間有條帶，則說明樣品中含有粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，如果PCR產物不在100～250bp之間或者沒有條帶時，說明樣品中沒有粟酒裂殖酵母。