[發(fā)明專(zhuān)利]植物蛋白多肽在玻璃化冷凍液中的應(yīng)用、玻璃化冷凍液組合物及制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110035123.9
• 申請(qǐng)日: 2021-01-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112772634B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟松;劉佳亮;李娜;譚良志
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 臺(tái)州靈江生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): A01N1/02
• 分類(lèi)號(hào): A01N1/02
• 代理公司: 藍(lán)天知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理(浙江)有限公司 33229
• 代理人: 孫煒

本發(fā)明屬于輔助生育的技術(shù)領(lǐng)域，涉及植物蛋白多肽在玻璃化冷凍液中的應(yīng)用，所述植物蛋白多肽用于制備玻璃化冷凍液，為冷凍液提供合適的粘度、滲透壓以及接近血清的環(huán)境，所述植物蛋白多肽的分子量為60000～80000道爾頓；上述植物蛋白多肽的制備方法是：以植物蛋白為原料，在中性磷酸緩沖液中，使用蛋白酶在37℃下水解，使植物蛋白酶解成分子量為60000～80000道爾頓的植物蛋白多肽，之后升溫至90℃～100℃滅酶，降至室溫，用微濾膜透析，收集透析液；本發(fā)明還提供了玻璃化冷凍液組合物及其制備方法。本發(fā)明提供了一種人血清蛋白的替代方案，使用植物蛋白多肽制備玻璃化冷凍液，具有成本更低，安全性更高的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于輔助生育的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種植物蛋白多肽在玻璃化冷凍液中的應(yīng)用、玻璃化冷凍液組合物及制備方法。

背景技術(shù)

生殖細(xì)胞和胚胎的冷凍技術(shù)是人類(lèi)輔助生殖技術(shù)的重要組成部分。由于生殖細(xì)胞和胚胎中含水量大，在冷凍過(guò)程中容易出現(xiàn)冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)機(jī)械損傷。目前使用的冷凍技術(shù)主要有程序化冷凍和玻璃化冷凍。程序性冷凍采用了較低濃度的滲透性防凍保護(hù)劑，通過(guò)精確的程序化緩慢降溫，防止出現(xiàn)較大的冰晶，提高解凍后的存活率。玻璃化冷凍采用了高濃度的防凍劑，快速降溫形成無(wú)定型的玻璃樣物質(zhì)，冷凍和解凍過(guò)程中不出現(xiàn)冰晶，防止了細(xì)胞在冷凍和解凍過(guò)程中的機(jī)械損傷。玻璃化冷凍技術(shù)以其操作簡(jiǎn)便快速、成活率高等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)成為生殖冷凍技術(shù)的新方向。

目前使用的玻璃化冷凍液一般由基礎(chǔ)液、滲透性保護(hù)、非滲透性保護(hù)劑、人血清蛋白等成分組成。其中人血清蛋白可以為冷凍液提供合適的粘度、滲透壓以及接近血清的環(huán)境，作用比較關(guān)鍵。

例如，中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)CN111280166A公開(kāi)了一種囊胚的玻璃化冷凍液及冷凍方法，包括平衡液、冷凍液1和冷凍液2；所述平衡液包括基礎(chǔ)平衡液和蛋白添加物；所述蛋白添加物在平衡液中的濃度為1～11mg/ml；所述冷凍液1包括聚乙烯砒咯烷酮、乙二醇、二甲亞砜和所述平衡液，所述冷凍液1中聚乙烯砒咯烷酮的濃度為1～100mg/ml；所述冷凍液2包括聚乙烯砒咯烷酮、乙二醇、二甲亞砜、海藻糖、聚蔗糖和所述平衡液，所述冷凍液2中海藻糖的濃度為0.1～1.2mol/L，聚蔗糖的濃度為2～35mg/ml，聚乙烯砒咯烷酮的濃度為1～100mg/ml。

又如，中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)CN108244102A、CN109644984A及CN108244100A均公開(kāi)了類(lèi)似的玻璃化冷凍液，上述專(zhuān)利雖然在其他成分上做了改進(jìn)，但都無(wú)一例外的使用了人血清蛋白。人血清蛋白成本較高，且存在攜帶病毒和交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，開(kāi)發(fā)一種易得、廉價(jià)、安全的成分替代人血清蛋白很有必要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不同，提供了一種人血清蛋白的替代方案，使用植物蛋白多肽制備玻璃化冷凍液，具有成本更低，安全性更高的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明提供了植物蛋白多肽在玻璃化冷凍液中的應(yīng)用：所述植物蛋白多肽用于制備玻璃化冷凍液，為冷凍液提供合適的粘度、滲透壓以及接近血清的環(huán)境，所述植物蛋白多肽的分子量為60000～80000道爾頓。

上述植物蛋白多肽的分子量與人血清蛋白66000～69000道爾頓的分子量相當(dāng)，從理論上可以替代人血清蛋白用于玻璃化冷凍液中。

上述分子量的植物蛋白多肽通過(guò)以下方法制備：以植物蛋白為原料，在中性磷酸緩沖液中，使用蛋白酶在37℃下水解，使植物蛋白酶解成分子量為60000～80000道爾頓的植物蛋白多肽，之后升溫至90℃～100℃滅酶，滅酶時(shí)間為10分鐘，之后降至室溫，用微濾膜透析，收集透析液。

本發(fā)明可以通過(guò)控制蛋白酶的加入量和酶解時(shí)間來(lái)控制植物蛋白多肽的分子量。例如，上述植物蛋白與磷酸緩沖液的質(zhì)量比為1：10左右，上述蛋白酶的加入量約為：每1g植物蛋白加入1萬(wàn)單位的蛋白酶。通過(guò)6小時(shí)左右的酶解，檢測(cè)多肽的分子量，植物蛋白多肽的分子量區(qū)間正好處于60000～80000道爾頓。當(dāng)然，也可以使用其他酶解條件，只需酶解后植物蛋白多肽的分子量控制在60000～80000道爾頓即可。