[發明專利]一種硫還原地桿菌胞外多糖的提取純化方法

有效

• 申請號: 202110029545.5
• 申請日: 2021-01-11
• 公開（公告）號: CN114316079B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 莊莉;林燦芬;莊正;楊貴芹
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

本發明公開了一種硫還原地桿菌胞外多糖的提取純化方法。本發明的方法包括如下步驟：將硫還原地桿菌的生物膜用濃度為體積比0.9％的NaCl溶液將懸浮，得到的生物膜懸浮液采用EDTA法粗提取，得到的粗提液采用Sevag法去除蛋白質，醇沉法分離胞外多糖，超濾管純化，得到硫還原地桿菌胞外多糖。本發明的方法保證多糖提取率的同時減少了胞內多糖的含量，在提高胞外多糖的分離率的同時減少無水乙醇的消耗；找到了最適宜的乙醇濃度以及醇沉時間；提取的胞外多糖含有較少的胞內多糖，為胞外多糖在胞外電子傳遞的研究中提供技術支持。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，特別涉及一種硫還原地桿菌胞外多糖的提取純化方法。

背景技術

多糖是一類高分子化合物，它廣泛存在與植物、動物、微生物中，參與能量轉運、發育分化、免疫調節等生命活動過程。細菌多糖可分為胞內多糖、莢膜多糖以及胞外多糖，實際的細菌培養中，莢膜多糖和胞外多糖難以區分，故有人將兩者統稱為胞外多糖。胞外多糖是胞外多聚物的重要組成部分，是細菌生長代謝過程中分泌到細胞壁外的一類糖類化合物，是游離于細胞外且能維持胞外基質穩定的粘液狀物質，主要有機成分是碳水化合物，蛋白質和腐殖質。胞外多糖有多種提取純化方法，不同的方法會影響胞外多糖的含量與純度。

硫還原地桿菌具有高效的胞外電子傳遞能力，屬于自然界中最普遍也是目前最受關注的電化學活性微生物之一，被廣泛應用于生物電化學的研究當中。近期研究發現菌毛被敲除后仍然能形成較薄的生物膜和較低的產電，說明胞外多糖會介導生物膜的形成，同時胞外多糖還會錨定更多的細胞色素C，這有利于遠距離的胞外電子傳遞。因此找到高效提取純化地桿菌胞外多糖的方法對胞外電子傳遞的研究具有重大意義。本發明提供了一種硫還原地桿菌(Geobacter?sulfurreducens?PCA)胞外多糖的提取純化方法。

發明內容

本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種硫還原地桿菌胞外多糖的提取純化方法。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種硫還原地桿菌胞外多糖的提取純化方法，包括如下步驟：

(1)懸浮：將硫還原地桿菌(Geobacter?sulfurreducens?PCA)的生物膜用濃度為體積比0.9％的NaCl溶液懸浮，得到生物膜懸浮液；

(2)提取和去蛋白：將生物膜懸浮液采用EDTA法粗提取，得到的粗提液采用Sevag法去除蛋白質；

(3)分離胞外多糖：加入乙醇，醇沉，離心，將沉淀物中加入去離子水，重懸浮，得到胞外多糖溶液；

(4)純化：將胞外多糖溶液采用超濾管過濾，離心，得到硫還原地桿菌胞外多糖。

步驟(1)中所述生物膜采用微生物燃料電池培養得到。

步驟(2)中所述采用EDTA法粗提取是加入與生物膜懸浮液等體積的2％Na₂-EDTA，混勻，4℃放置4h，5000g、4℃下離心20min，取上清液，過濾，得到粗提液。

所述過濾為采用孔徑為0.22μm的濾膜過濾。

步驟(2)中所述Sevag法去除蛋白質：將由氯仿和正丁醇以4：1的體積比配制的Sevag液與粗提液按1：4的體積比混合，劇烈振蕩30min，6000r/min離心10min，取上層水層；重復用Sevag法除蛋白5次，直至蛋白質被去除80％。

步驟(3)中所述乙醇用量為體系中濃度為體積比80％；

步驟(3)中所述醇沉為4℃醇沉24h。

步驟(3)中所述離心為6000r/min，離心10min。

步驟(3)中所述去離子的用量為5mL。

步驟(4)中所述超濾管為Millipore?3KD超濾管。