[發明專利]一種β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶159及其克隆表達與應用

在審

• 申請號: 202110028065.7
• 申請日: 2021-01-11
• 公開（公告）號: CN112795556A
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 陳可泉;陳燕;張阿磊;陳雪曼;周寧;楊鵬帆;王瑩瑩;魏國光;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/26;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 南京先科專利代理事務所(普通合伙) 32285
• 代理人: 繆友菊

本發明公開了一種β?N?乙酰氨基葡萄糖苷酶159及其克隆表達與應用。通過基因工程手段將β?N?乙酰氨基葡萄糖苷酶159的基因構建在質粒pET?28a(+)上，并轉入E.coli BL21(DE3)中表達，該重組酶分子量大小為92kDa，通過對比分析，β?N?乙酰氨基葡萄糖苷酶159屬于糖苷水解酶GH20家族。對該重組酶進行酶學性質研究表明，純酶的比活力為16.67 U/mg，其最適溫度為40℃，最適pH為9.0，在pH高于7的條件下能保持高于80%的酶活，與其他幾丁質酶協同作用時，β?N?乙酰氨基葡萄糖苷酶159表現出較高的pH穩定性和協同效應,為高效制備N?乙酰氨基葡萄糖提供了理論基礎。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶159及其克隆表達與應用。

背景技術

幾丁質又稱甲殼素、殼多糖，是由N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵連接的聚合物，是地球上除纖維素外含量最高的多聚糖。其分布十分廣泛，主要存在于蝦蟹殼、昆蟲的外骨骼和真菌細胞壁中，其水解產物N-乙酰氨基葡萄糖可以保護軟骨組織及骨關節。幾丁質酶可以防治植物的真菌類病害，在食品、醫藥、農業以及化妝品等行業具有廣泛應用。

以幾丁質為底物制備N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的方法主要可分為是化學法和酶法，目前工業上多采用化學法，此法存在反應過程控制較難，伴有副產物產生，且產物的生物活性差等缺陷。而且對環境污染嚴重，三廢處理成本高。因此，尋找綠色高效的GlcNAc的制備方法具有重要意義。

幾丁質酶（Chitinase， EC3.2.1.14）是一種糖苷水解酶，能專一水解幾丁質生產GlcNAc及幾丁寡糖的糖苷水解酶，按切割糖苷鍵的方式的不同可分為外切幾丁質酶(EC3.2.1.20)，內切幾丁質酶(EC 3.2.1.14)及β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGases，EC3.2.1.52)，外切幾丁質酶從幾丁質糖鏈的非還原末端將幾丁質降解為（GlcNAc）₂，內切幾丁質酶與外切幾丁質酶有所不同，其可隨機作用于幾丁質長鏈的任何一個糖苷鍵，并將其水解成幾丁寡糖；而N-乙酰氨基葡萄糖苷酶主要水解幾丁寡糖為單糖GlcNAc，因其反應條件溫和、控制性強、產物生物活性好且綠色環保，這種生物酶法處理幾丁質將成為現代幾丁質產業發展方向，具有巨大的發展前景。

目前，GlcNAc已廣泛用于生產唾液酸、生物乙醇和單細胞蛋白質；在醫藥領域可以作為腸胃炎、骨關節炎的藥物，還可應用于癌癥診斷(Chen J.K.,Shen C.R.and LiuC.L.N-Acetylglucosamine:Production andApplications.MarineDrugs,2010,8:2493-2516)。因此，N-乙酰氨基葡萄糖的綠色生物生產具有重要的意義和應用價值。近年來，酶法制備N-乙酰氨基葡萄糖因其高效無污染而被廣泛關注。如專利號2015107793579利用幾丁質酶與幾丁質的親和吸附可高效生產N-乙酰氨基葡萄糖。Suresh等(Suresh P.V.andKumarP.K.A.Enhanced degradation of a-chitin materials prepared fromshrimpprocessing byproduct and production of N-acetyl-D-glucosamine bythermoactivechitinases from soil mesophilic fungi.Biodegradation,2012,23:597-607)利用幾丁質酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶水解幾丁質粉末生產N-乙酰氨基葡萄糖，得率為23.7％。因此，挖掘具有更高酶活的新型β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶對于幾丁寡糖的高效煉制具有重要意義。

發明內容