[發明專利]一種β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶159及其克隆表達與應用

在審

• 申請號: 202110028065.7
• 申請日: 2021-01-11
• 公開（公告）號: CN112795556A
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 陳可泉;陳燕;張阿磊;陳雪曼;周寧;楊鵬帆;王瑩瑩;魏國光;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/26;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 南京先科專利代理事務所(普通合伙) 32285
• 代理人: 繆友菊

1.一種β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶159，其特征在于，所述β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶159的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一種核苷酸，其特征在于，編碼權利要求1所述的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶159的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.一種重組質粒，其特征在于，含有權利要求2所述的編碼β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶159的核苷酸序列。

4.一種重組菌株，其特征在于，表達權利要求3所述的重組質粒的菌株。

5.基于權利要求4所述的重組菌株的構建方法，包括以下步驟：

步驟1，PCR擴增SEQ ID NO:1所示的序列

擴增引物為159-F-Primer：5’-ATTCTAGCT ATGAACAAGCCAGCAGGTG-3’；

159-R-Primer：5’-ATTCCGCTCCGCCAGCAAAGTACGCCTGAC-3’；

上述PCR擴增的反應條件為：95℃預變性5 min；94℃ 30sec、55℃ 30sec、72℃ 40sec，30個循環；最后在72℃下延伸10min；

步驟2，構建重組質粒pET-28a(+)-159

將步驟1擴增的序列和pET-28a(+)質粒均用NdeI和XhoI限制性內切酶進行雙酶切，酶切產物進行回收純化，再用T4DNA連接酶連接純化的酶切產物，得到重組質粒pET-28a(+)-159；

步驟3，將得到的重組質粒pET-28a(+)-159導入大腸桿菌BL21（DE3），得到含有重組質粒pET-28a(+)-159的大腸桿菌BL21（DE3），命名為重組菌；

步驟4，挑選重組菌的單克隆，搖床過夜培養后，將種子液以體積分數1%-5%接種量接入含有100μg/L卡那霉素LB培養基，37℃下培養菌OD₆₀₀為0.4-0.6時，加入誘導劑在18℃誘導14-16h后收集發酵液，再在4℃進行6000-8000g離心，收集菌株；

步驟5，向沉淀中加入10mL 50mM PBS緩沖液重懸細胞，超聲破碎后，離心收集上清后冷凍備用。

6.基于權利要求1所述的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶159在降解膠體幾丁質上的應用。