[發明專利]一種定量檢測多個NUP98融合基因的方法和試劑盒

在審

• 申請號: 202110024565.3
• 申請日: 2021-01-08
• 公開（公告）號: CN114752659A
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發明（設計）人: 倪潤芳;郭婷婷;趙菁;宋娜杰
• 申請（專利權）人: 廈門致善生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 中國貿促會專利商標事務所有限公司 11038
• 代理人: 崔錫強

1.一種定量檢測多個NUP98融合基因的方法，所述方法包括：

(a)提供含有不同NUP98融合基因的靶核酸的樣品，并且，針對每一種靶核酸，提供能夠擴增所述靶核酸的引物組，所述引物組包含至少一條上游引物和至少一條下游引物，其中，所述上游引物能夠靶向所述靶核酸中編碼NUP98蛋白的核苷酸的序列；

以及，針對每一種靶核酸，提供能夠與所述靶核酸中NUP98融合基因的序列特異性雜交的檢測探針，所述檢測探針標記有報告基團和淬滅基團，其中，所述報告基團能夠發出信號，并且，所述淬滅基團能夠吸收或淬滅所述報告基團發出的信號；并且，所述檢測探針在與其互補序列雜交的情況下發出的信號不同于在未與其互補序列雜交的情況下發出的信號；

優選地，所述引物組包含一條上游引物和多條下游引物(例如，2條，5條，10條，11條，或更多條)；

(b)在允許核酸擴增的條件下，通過熒光定量PCR，使用所述引物組以及所述檢測探針對所述含有不同NUP98融合基因的靶核酸進行擴增，從而獲得與擴增產物對應的擴增曲線以及Ct值；

(c)以倍比稀釋的擴增產物的濃度對數值為橫坐標，以擴增產物對應的Ct值為縱坐標，分別構建擴增產物濃度與Ct值之間的標準曲線；

優選地，對標準曲線的參數進行檢測，判斷所述標準曲線能否用于NUP98融合基因的定量檢測；其中，所述參數選自標準曲線的相關系數，擴增效率，斜率，或其任何組合；

更優選地，當標準曲線的相關系數(R)的平方大于0.99，擴增效率大于85％，斜率在-3.0至-4.0之間時，所述標準曲線可用于NUP98融合基因的定量檢測；

(d)通過Ct值與濃度的倍比關系，獲得樣品的靶核酸中不同NUP98融合基因的濃度；

優選地，所述NUP98融合基因的序列包含編碼NUP98蛋白的核苷酸的全部或部分序列和編碼NUP98的伙伴蛋白(例如，HHEX、HOXD13、LOC348801、TOP1、KDM5、DDX10、NDS1、NDS3、LEDGF、ADD3或PHF23)的核苷酸的全部或部分序列；

優選地，所述NUP98融合基因的序列選自SEQ ID NO:28至SEQ ID NO:38。

2.權利要求1的方法，在步驟(a)中，還提供含有內參基因(例如，GUS基因)的靶核酸的樣品；并且，針對所述靶核酸，提供能夠擴增所述靶核酸的引物組，所述引物組包含至少一條上游引物和至少一條下游引物；

以及，針對所述靶核酸，提供能夠與所述靶核酸中內參基因的序列特異性雜交的檢測探針，所述檢測探針標記有報告基團和淬滅基團，其中，所述報告基團能夠發出信號，并且，所述淬滅基團能夠吸收或淬滅所述報告基團發出的信號；并且，所述檢測探針在與其互補序列雜交的情況下發出的信號不同于在未與其互補序列雜交的情況下發出的信號；

優選地，所述上游引物能夠靶向所述靶核酸中編碼GUS蛋白的核苷酸的序列；

(b)在允許核酸擴增的條件下，通過熒光定量PCR，使用所述引物組以及所述檢測探針對所述含有內參基因的靶核酸進行擴增，從而獲得與擴增產物對應的擴增曲線以及Ct值；

(c)以倍比稀釋的擴增產物的濃度對數值為橫坐標，以擴增產物對應的Ct值為縱坐標，構建擴增產物濃度與Ct值之間的標準曲線；

優選地，對標準曲線的參數進行檢測，判斷所述標準曲線能否用于內參基因的定量檢測；其中，所述參數選自標準曲線的相關系數，擴增效率，斜率，或其任何組合；

更優選地，當標準曲線的相關系數(R)的平方大于0.99，擴增效率大于85％，斜率在-3.0至-4.0之間時，所述標準曲線可用于內參基因的定量檢測；

(d)通過Ct值與濃度的倍比關系，獲得樣品的靶核酸中內參基因的濃度；

優選地，所述內參基因為GUS基因；

優選地，所述GUS基因的序列如SEQ ID NO:39所示；

優選地，所述引物組的引物序列為SEQ ID NO:25和26。

3.權利要求1或2的方法，其中，在步驟(a)中，所述靶核酸是cDNA；優選地，所述cDNA是通過提取樣品的RNA并反轉錄獲得的。