[發明專利]一種幾丁質內切酶CmChi4及其克隆表達與應用

在審

• 申請號: 202110021973.3
• 申請日: 2021-01-08
• 公開（公告）號: CN112941054A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 陳可泉;陳雪曼;張阿磊;陳燕;周寧;魏國光;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/26;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 南京先科專利代理事務所(普通合伙) 32285
• 代理人: 繆友菊

本發明公開了一種幾丁質內切酶CmChi4及其克隆表達與應用。通過基因工程手段將幾丁質酶基因CmChi4構建在質粒pCOLDI上，并轉入E.coli BL21(DE3)中表達，該重組酶分子量大小為72.1kDa。對CmChi4酶學性質研究表明，在溫度50℃、pH為6時活力最佳；Fe²⁺、K⁺、Al³⁺和Zn²⁺對酶CmChi4具有較強的激活。此外，幾丁質內切酶CmChi4水解膠體幾丁質的產物為(GlcNAc)₂、(GlcNAc)₃和(GlcNAc)₄，穩定性好，適合產業化。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種幾丁質內切酶CmChi4及其克隆表達與應用。

背景技術

幾丁質（Chitin）分子式為(C₈H₁₃O₅N)_n，是由N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的多聚物。幾丁質作為一種重要的生物質資源，在地球上的含量僅次于纖維素，年自然合成量約為10¹¹噸。它廣泛存在于海洋生物蝦蟹貝類的外殼、昆蟲外骨骼及真菌細胞壁中。然而，數量龐大的甲殼資源至今沒能得到良好的利用，通常都被當作廢棄物肆意堆積堆積或丟棄，造成環境污染及空間資源的浪費。近年來，甲殼資源的高效綠色煉制已作為科研熱點逐漸被提上議程。

幾丁寡糖是幾丁質煉制的重要產物，被廣泛應用于抗腫瘤藥物的開發制備研究，同時也作為重要的飼料添加劑廣泛應用于食品、飼料等領域。目前制備幾丁寡糖的傳統方法為酸水解法，該過程具有反應劇烈、反應條件苛刻、環境污染大、產物聚合度不可控、產品生物活性差等缺陷，強酸的使用又為后續處理增加成本，嚴重違背綠色可持續發展的戰略國策。生物酶法降解幾丁質制備幾丁寡糖因其反應溫和、過程綠色、產品生物活性好，且高效利用廢棄甲殼資源等優勢，已逐步成為生物質多糖煉制的熱點研究。

幾丁質酶在生物界分布廣泛，按切割糖苷鍵的方式的不同可分為外切幾丁質酶，內切幾丁質酶及N-乙酰葡萄糖苷酶。外切幾丁質酶從幾丁質糖鏈非還原末端將幾丁質降解為(GlcNAc)₂，內切幾丁質酶可隨機作用于幾丁質長鏈的任何一個糖苷鍵，并將其水解成幾丁寡糖；而N-乙酰氨基葡萄糖苷酶可水解幾丁寡糖為GlcNAc。論文“來源于苜蓿鏈霉菌的糖苷水解酶19家族幾丁質酶的性質研究與應用”中報道了一個具有高活性的內切幾丁質酶SaChi19B，在組合了一個N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的作用下，降解幾丁質6h得到較高產率的GlcNAc；專利CN111996205A 公開了一種利用畢赤酵母表達幾丁質內切酶制備幾丁寡糖的方法，該方法通過甲醇誘導120h過表達幾丁質酶，發酵成本較高且周期較長，不適合產業化。

因此，挖掘具有更多高酶活的新型幾丁質內切酶對于幾丁寡糖的高效煉制具有重要意義。

發明內容