[發(fā)明專利]一種非診斷目的的單精子活性氧的定量檢測方法及其應用

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• 申請日: 2021-01-07
• 公開（公告）號: CN112834473A
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發(fā)明（設計）人: 熊承良;肖先金;相文佩;胡浩
• 申請（專利權）人: 華中科技大學;華中科技大學同濟醫(yī)學院生殖醫(yī)學中心（武漢同濟生殖醫(yī)學專科醫(yī)院）;江蘇瑞明生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京金智普華知識產(chǎn)權代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

本發(fā)明屬于精子檢測技術領域，尤其涉及一種非診斷目的的單精子活性氧的定量檢測方法及其應用。本發(fā)明創(chuàng)造性地使用可移動的微型激發(fā)光探頭，將其定位到單個精子附近，并構建了完整的檢測流程，包括：處理、定位、降噪、測量、基線處理等步驟。最終實現(xiàn)了對單個精子的散發(fā)熒光強度進行精確定量，并且可以準確地給出精子胞內活性氧數(shù)值；本發(fā)明是領域內首創(chuàng)的單個精子水平的活性氧檢測，填補了領域空白，而且本發(fā)明對精子數(shù)目沒有限制，能適用于包括重度少精子癥在內的幾乎所有患者。

技術領域

本發(fā)明屬于精子檢測技術領域，尤其涉及一種非診斷目的的單精子活性氧的定量檢測方法及其應用。

背景技術

活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是指存在于所有生活在含氧環(huán)境中的生物體的不穩(wěn)定的、化學性質活潑的、氧化能力很強的氧衍生物。這些氧衍生物是正常代謝過程中的副產(chǎn)物，它們包括超氧陰離子(O2·-)、過氧化氫(H2O2)、氫氧基(·OH)、氫過氧自由基(HO2)、過氧化脂質(ROOH)等。研究發(fā)現(xiàn)，生物體產(chǎn)生的過量ROS和抗氧化防御系統(tǒng)之間的失衡會導致氧化應激，氧化應激在很多病理過程中都起著重要作用，包括男性不育。

由男方原因造成的不育稱為男性不育，約占男女不育因素的50％。并且，大約30％-50％的男性不育確切病因不明，被稱為特發(fā)性男性不育，最近文獻表明，30％-80％的不育男性精液中的活性氧水平升高，高水平的活性氧引起的氧化應激會導致精子膜脂質過氧化損傷、精子DNA損傷、精子線粒體損傷及細胞凋亡，從而破壞精子活性和功能，包括對精子的發(fā)生、前向運動、獲能、頂體反應、受精等多環(huán)節(jié)產(chǎn)生不同程度的影響，進而損害男性生育能力。因此，活性氧對于男性不育和人類生殖有重要影響。有學者提出，在特發(fā)性男性不育癥患者中若發(fā)現(xiàn)精液或精子中活性氧指標升高，可以診斷為男性氧化應激性不育。因此檢測男性精液和精子中活性氧水平是診斷男性不育和評估男性不育治療療效的重要指標之一。

目前，化學發(fā)光法和熒光探針法由于具有操作簡便、反應靈敏、費用較低等優(yōu)點，成為臨床上定量檢測精子活性氧的主要手段。其中化學發(fā)光法多以魯米諾為發(fā)光劑，通過化學發(fā)光計檢測被精子活性氧氧化的魯米諾的發(fā)光強度來確定活性氧含量。然而，不帶電荷的魯米諾分子是一種膜透過性分子，可以與精子內和精漿中各種活性氧反應，因此魯米諾的化學發(fā)光分析提供的是精液活性氧總體水平，而無法特異性顯示精子活性氧水平。實際工作中，精子中活性氧水平較精液中活性氧水平更具臨床意義，更能反映精子質量優(yōu)劣和男性生育能力。考慮到化學發(fā)光法無法直接對精子進行檢測的缺點，科研人員使用熒光探針法來檢測。臨床測定精子活性氧所用的熒光探針法以2'-7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)為探針，以流式細胞儀為檢測儀器。DCFH-DA是DCF的一種細胞可滲透的非熒光前體，它對細胞氧化還原狀態(tài)的變化極為敏感。細胞內酯酶在兩個酯鍵處裂解DCFH-DA，產(chǎn)生相對極性且細胞膜不可滲透的產(chǎn)物H2DCF。該非熒光分子在細胞內積累，隨后被精子內ROS氧化產(chǎn)生強熒光產(chǎn)物DCF，再通過流式細胞儀檢測熒光的增加來監(jiān)測精子的ROS水平。但是，流式細胞儀具有以下兩方面不足：一是流式細胞儀將受檢樣品分為單個小液滴通過檢測區(qū)域，每個液滴里含有一個細胞，因此檢測的是整個液滴的熒光強度，而不是精子自身的；二是流式細胞儀的激發(fā)光聚焦在特定的平面，待檢的單個液滴會因為偏離聚焦平面導致收集的散發(fā)熒光不能準確反映其熒光物質含量，進而導致無法準確測量ROS含量。因此，流式細胞儀只能給出精子胞內熒光信號是否超過設定熒光值的判斷(Yes or No)，無法準確計算熒光值的高低，因而最終報告的結果是：超過熒光設定值的精子的“比例”，并不是真正的精子胞內活性氧的“含量”。綜上所述，現(xiàn)有方法均無法直接定量檢測精子胞內的活性氧水平，該研究是生殖臨床檢測領域內的一大空白。

發(fā)明內容

針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供了一種非診斷目的的單精子活性氧的定量檢測方法及其應用，目的在于解決現(xiàn)有技術中的一部分問題或至少緩解現(xiàn)有技術中的一部分問題。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種非診斷目的的單精子活性氧的定量檢測方法，包括以下步驟：