[發明專利]一種非診斷目的的單精子活性氧的定量檢測方法及其應用

在審

• 申請號: 202110020297.8
• 申請日: 2021-01-07
• 公開（公告）號: CN112834473A
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 熊承良;肖先金;相文佩;胡浩
• 申請（專利權）人: 華中科技大學;華中科技大學同濟醫學院生殖醫學中心（武漢同濟生殖醫學專科醫院）;江蘇瑞明生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

1.一種非診斷目的的單精子活性氧的定量檢測方法，包括以下步驟：

樣品處理：將精液置于37℃孵育后，離心保留沉淀；沉淀中加入清理液混勻，重復多次離心去上清的操作；向最后一次的沉淀中加入稀釋后的染色液，混勻；37℃恒溫避光孵育；離心，沉淀用PBS混勻；離心，沉淀用PBS混勻，得到精子懸液；

精子定位：將精子懸液置于培養皿中，于單細胞分析儀下進行檢測，調節顯微鏡使精頭清晰顯示在視野中央，調節微操系統和細胞定位系統，使探頭定位到精子頭部，呈現緊貼精子頭部同時又不會使精子出現形變或者位移的狀態；

活性氧水平測量：根據單細胞分析儀的操作說明進行熒光檢測，得到熒光值A；

基線處理：得到計數值A后，打開顯微鏡側艙門，打開顯微鏡側鹵素燈，調節微操系統和細胞定位系統，將光探頭移動到精子頭部周圍30μm處，同時保證探頭激光不會照射到該精子和周圍精子；關閉顯微鏡側照明燈和鹵素燈，緩慢關閉顯微鏡側艙門以防止探頭移位，開始光子計數；30S后計數自動停止，保存計數結果，多次操作取平均值記作B，表示被測精子的背景基線值；A與B的差值特異性代表樣品精子胞內活性氧水平。

2.根據權利要求1所述的一種非診斷目的的單精子活性氧的定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

樣品處理：將精液置于37℃孵育后，離心保留沉淀；沉淀中加入清理液混勻，重復多次離心去上清的操作；向最后一次的沉淀中加入稀釋后的染色液，混勻；37℃恒溫避光孵育；離心，沉淀用PBS混勻；離心，沉淀用PBS混勻，得到精子懸液；

精子定位：將精子懸液置于培養皿中，于單細胞分析儀下進行檢測；單細胞分析儀的操作包括：打開鹵素燈，調節光源強度及顯微鏡焦距，讓精子在4倍物鏡下能顯示清晰；將直徑與精子頭部相近的激發光探頭裝配到分析儀顯微操作系統動力端；在顯微鏡下觀察的同時調節微操系統，讓探頭在4倍物鏡下浸入液滴，并清晰地顯示在視野中央；將顯微鏡物鏡調整為10倍，調節顯微鏡微調旋鈕、微操系統和細胞定位系統，使精子和探頭清晰顯示在視野中央；將顯微鏡物鏡調整為20倍，調節顯微鏡微調旋鈕、微操系統和細胞定位系統，使精子和探頭清晰顯示在視野中央；將顯微鏡物鏡調整為40倍，調節顯微鏡微調旋鈕、微操系統和細胞定位系統，使精子和探頭清晰顯示在視野中央；將顯微鏡物鏡調整為60倍，調節顯微鏡微調旋鈕讓精頭清晰顯示在視野中央，調節微操系統和細胞定位系統，使探頭定位到精子頭部，呈現緊貼精子頭部同時又不會使精子出現形變或者位移的狀態；

活性氧水平測量：打開觸屏控制面板上激發光源電源按鈕，點擊計算機桌面的“SCanalysis”圖標，打開軟件控制界面，單擊“LASER”圖標，點擊“+”，提示連接端口及設備，選擇“Com7-DC4100-4”，點擊“ACCEPT”，連接相應的激發光源；由于本專利使用染料激發波長為490nm，散發熒光波長為530nm，所以點擊藍色“圓形控件”，同時把過濾組塊調節到B組塊；打開軟件控制界面，單擊“PHOTON COUNTING”，進入計數器工作界面，選擇左側串口號為“com1”，點擊“設置”，單次測量時長設置為30S，門控時間設置為1000ms，穩定時間設置為10ms，脈沖對分辨時間設置為20ns；當顯示參數設置成功后，即可進行熒光檢測；關閉顯微鏡側照明燈和鹵素燈，緩慢關閉顯微鏡側艙門以防止探頭移位，點擊“PHOTON COUNTING”的“開始”按鍵以開始光子計數；30S后計數自動停止，保存光子計數結果A；A表示精子頭部所在區域散發出的熒光值；

基線處理：得到計數值A后，打開顯微鏡側艙門，打開顯微鏡側鹵素燈，調節微操系統和細胞定位系統，將光探頭移動到精子頭部周圍30μm處，同時保證探頭激光不會照射到該精子和周圍精子；關閉顯微鏡側照明燈和鹵素燈，緩慢關閉顯微鏡側艙門以防止探頭移位，點擊“PHOTON COUNTING”的“開始”按鍵以開始光子計數；30S后計數自動停止，保存計數結果B1；再重復1-3操作2次，總共可得到三個被測精子頭部周圍30μm處背景熒光值，B1、B2、B3，其平均值B表示被測精子的背景基線值；A與B的差值則能特異性代表該精子胞內活性氧水平。

3.根據權利要求1所述的一種非診斷目的的單精子活性氧的定量檢測方法，其特征在于：精液與清理液的用量體積比為0.3:2。