[發明專利]一種秀麗隱桿線蟲對病原細菌遺忘的動物模型的建立方法

在審

• 申請號: 202110020119.5
• 申請日: 2021-01-07
• 公開（公告）號: CN112772560A
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 鄒偉;王琦;柏樺;張敏
• 申請（專利權）人: 昆明醫科大學
• 主分類號: A01K67/02
• 分類號: A01K67/02
• 代理公司: 昆明合盛知識產權代理事務所(普通合伙) 53210
• 代理人: 牛林濤

本發明公開一種秀麗隱桿線蟲對病原細菌遺忘的動物模型的建立方法，具體包括以下步驟：將秀麗隱桿線蟲進行同步化處理，培養至青年狀態，將部分線蟲加入到涂滿PA14細菌平板上訓練4h；訓練完成后將其分別移入M9培養基中，設置0.5h、1h、2h、4h遺忘時間點，檢測對照組線蟲、PA14訓練線蟲、不同時間點遺忘線蟲偏好指數，繪制遺忘曲線；通過檢測病原處理前、處理時、移除后，線蟲對病原細菌的偏好指數的變化以明確遺忘時間點。本發明所述方法建立的模型可用于研究秀麗隱桿線蟲對病原菌的記憶遺忘機制，還用于研究病原菌與宿主之間的相互作用關系。

技術領域

本發明涉及一種秀麗隱桿線蟲對病原細菌遺忘的動物模型的建立方法，屬于生物模型構建技術領域。

背景技術

遺忘型輕度功能認知障礙、短暫性全面遺忘癥、阿爾茨海默病(Alzheimer,sdisease，AD)等疾病都和遺忘行為異常相關。其中，輕度認知障礙(mild cognitiveimpairment，MCI)是介于正常衰老與癡呆之間的狀態，分為遺忘型MCI(amnestic MCI，aMCI)和非遺忘MCI(non-amnestic MCI)。遺忘型MCI最易發展成為AD源性癡呆(dementiadue to AD)。在中國一項針對阿爾茨海默病以及其他癡呆病癥的系統性研究顯示，隨著人口老齡化問題的凸顯，AD的發病率在日趨升高。阿爾茨海默病必然會長期對中國的家庭、社會、經濟以及公共衛生系統造成巨大的壓力，對其發病的生物學機制深入研究已刻不容緩。遺忘行為異常是AD發病的重要特點之一，因此弄清遺忘行為異常的機制顯得尤為重要。過往的研究主要以果蠅、小鼠為模型探索遺忘機制，但由于其遺傳學操作復雜、耗時，因此得不到推廣和普及。

自然環境中，秀麗隱桿線蟲是生活在土壤中的一種微小生物，它們以土壤有機細菌為食物。線蟲體型較小，長度約為3-5mm，按照性別可分為雄蟲和雌雄同體兩種，其中雌雄同體線蟲為主要組成部分尤為常見，而雄蟲較少一般比例約為千分之一。在整個發育階段，大致可將其生活史劃分為2個時期，分別為幼蟲階段和性成熟階段。而幼蟲階段又可分為L1，L2，L3和L4，L4期線蟲的生殖腺基本發育完全，接下來進入成蟲期，這個時期線蟲大量產卵。在實驗室環境中培養線蟲，其生活周期短、產卵量多、易于進行遺傳學操作，大量線蟲突變株已經構建完成。此外，線蟲對氣味、溫度、光線等物理因素反應敏感，身體呈透明狀，在發育過程當中，容易在顯微鏡下對其進行跟蹤觀察。作為第一個完成測序的多細胞生物體，其基因組約有40％和哺乳動物同源，并且線蟲神經元之間的連接相對清楚，哺乳動物的一些重要的神經肽在線蟲中也被發現，因此是研究神經元調控行為學變化的絕佳模型。因此，建立一種秀麗隱桿線蟲病原遺忘模型非常有必要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種秀麗隱桿線蟲對病原細菌遺忘的動物模型的建立方法，具體包括以下步驟：

(1)將秀麗隱桿線蟲進行同步化處理，培養至青年狀態，將部分線蟲加入到涂滿PA14細菌平板上訓練4h。

(2)訓練完成后，設置不同的遺忘時間點(0.5h、1h、2h、4h)，檢測秀麗隱桿線蟲、PA14訓練線蟲、不同時間點產生遺忘線蟲偏好指數，繪制遺忘曲線。

(3)通過檢測病原處理前、處理時、移除后，線蟲對病原細菌的偏好指數的變化和恢復明確遺忘時間點。

優選的，本發明所述秀麗隱桿線蟲進行同步化的具體過程為：

①將保存于固體平板上的線蟲切小塊置于新鮮的OP50平板上，20℃培養箱培養48小時，并注意觀察，平板上出現大量蟲卵即可；如果培養過程中出現食物不夠的情況，則在平板中加入離心濃縮后的OP50食物。

②待平板上出現大量蟲卵后，用M9溶液將線蟲和蟲卵沖洗于14ml的收集管中3000rpm，離心2分鐘；沖洗過程一定要充分以免造成蟲卵的大量損失。