[發明專利]一種alpha-L-鼠李糖苷酶、其制備方法及應用

在審

• 申請號: 202110019048.7
• 申請日: 2021-01-07
• 公開（公告）號: CN113584001A
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 袁其朋;程磊雨
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12P19/60;C12P19/14;C12R1/84;C12R1/645
• 代理公司: 北京國林貿知識產權代理有限公司 11001
• 代理人: 李瑾;李連生

本發明公開了一種alpha?L?鼠李糖苷酶、其制備方法及應用。具體涉及一種新型alpha?L?鼠李糖苷酶的氨基酸序列、編碼上述氨基酸序列的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的重組載體和重組宿主、利用上述重組宿主制備alpha?L?鼠李糖苷酶的方法以及所述alpha?L?鼠李糖苷酶在寶霍苷I生產中的應用。本發明所提供的alpha?L?鼠李糖苷酶具有催化效率高、熱穩定性好、特異性高等優點。朝藿定C經葡萄糖苷酶快速催化水解后，再利用本發明中所提供的alpha?L?鼠李糖苷酶進一步催化水解其C₃位置外側鼠李糖苷鍵生成寶霍苷I，底物轉化率高達99.5%、轉化效率高、無副產物、步驟簡單、反應時間短、污染小、適合工業化生產。

技術領域

本發明屬于基因工程和生物轉化領域，具體涉及一種alpha-L-鼠李糖苷酶、其制備方法及應用。

背景技術

淫羊藿又名仙靈脾、剛前，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕等功效。目前淫羊藿品種多達40個，包括柔毛淫羊藿、箭葉淫羊藿和朝鮮淫羊藿等。 淫羊藿藥材中主要含有朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷等主要黃酮苷，其中淫羊藿苷占比10%左右；朝藿定A和B合計占比10%；而朝藿定C（圖1）是淫羊藿中含量最高的黃酮皂苷，約占70%，其C₃位置和C₇位置分別帶有兩個鼠李糖基和一個葡萄糖基。

寶藿苷I（圖1），又名淫羊藿次苷II（Icariside II），具有抗腫瘤、治療骨質疏松、調節免疫力等功效，市場應用前景廣闊。天然植物中寶霍苷I的含量很少（低于0.2%），因而寶霍苷I 的制備通常采用水解黃酮苷實現，如可通過水解去掉淫羊藿苷C₇位置葡萄糖苷鍵獲得寶霍苷I，其結構式如圖1。由于酸解法具有環境污染大，特異性低等缺點而很少被應用于寶霍苷I的制備。

目前寶霍苷I 的制備多采用酶催化法，具有條件溫和，特異性高，環境污染小等優點。寶霍苷I的制備最初采用葡萄糖苷酶或產葡萄糖苷酶的微生物來轉化淫羊藿苷（圖1）得到寶霍苷I（中國專利申請號：200780034447.9），后來又報道有其他葡萄糖苷酶、纖維素酶或葡聚糖酶也可以實現寶霍苷I的生產（中國專利申請號：201110186207.9、201880038006.4、201710333064.7、201110428197.5），相關報道的糖苷酶水解斷裂的是淫羊藿苷C₇位置的葡萄糖苷鍵，且酶催化的效率有限。此外，中國專利（中國專利申請號:201810110773.3）公開了一種鼠李糖苷酶水解朝藿定C外側鼠李糖苷鍵，彌補了使用alpha-L-鼠李糖苷酶水解朝藿定C鼠李糖與鼠李糖之間的alpha-1,2糖苷鍵的空白，但是摩爾轉化率只有90.5%。因此一種高活性，高催化效率的糖苷酶對于寶藿苷I的制備至關重要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新型alpha-L-鼠李糖苷酶、編碼所述糖苷酶的核苷酸序列、用于表達所述糖苷酶的表達載體、包含或整合所述表達載體的宿主細胞以及所述alpha-L-鼠李糖苷酶在寶霍苷I生產中的應用。提供本發明是根據現有鼠李糖苷酶催化效率低、底物轉化率低以及反應時間長等不足作出創新和改進。

為實現上述發明目的，本發明提供了以下技術方案：

一種alpha-L-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或為將SEQ IDNO.1經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加而形成的有alpha-L-鼠李糖苷酶活性的蛋白質，該蛋白質優選為與SEQ ID NO.1有60%以上的相似度，更優選為80%或90%以上。

一種核苷酸序列，編碼所述的alpha-L-鼠李糖苷酶，或者為SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。其中編碼SEQ ID NO.1氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。