[發明專利]一種高產谷胱甘肽畢赤酵母菌株G3-SA及其應用

在審

• 申請號: 202110011525.5
• 申請日: 2021-01-06
• 公開（公告）號: CN112646738A
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 許正宏;史勁松;徐國強;高宇豪;徐建國;付靜;曹崢;吳勇杰
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/52;C12N15/54;C12N15/81;C12N15/66;C12P21/02;C07K5/037;C12R1/84
• 代理公司: 無錫承果知識產權代理有限公司 32373
• 代理人: 張婷婷

本發明公開了一種高產谷胱甘肽畢赤酵母菌株G3?SA及其應用，以畢赤酵母GS115為宿主，異源表達來源于釀酒酵母的Scgsh1和Scgsh2基因，獲得了GSH的過量生產，將工程菌命名為G3；在此基礎上，異源表達來源于釀酒酵母腺苷激酶Scadk1，旨在增強發酵過程中的能量供應。谷胱甘肽搖瓶水平最高產量可達(465.50±29.90)mg/L，胞內谷胱甘肽得率為(16.87±0.63)mg/L/OD。對所構工程菌G3?SA進行5L發酵罐發酵，谷胱甘肽在56h最高產量為4810mg/L，胞內谷胱甘肽得率為19.87mg/L/OD，為GSH的工業生產提供新思路。

技術領域

本發明屬于生物合成技術領域，具體涉及一種高產谷胱甘肽畢赤酵母菌株G3-SA及其應用。

背景技術

谷胱甘肽是一種三肽活性物質，廣泛存在于動物、植物和微生物中，具有保護和調節細胞內氧化還原平衡的作用。其分子量為307.33，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，在各種生物的體內含量各不相同，其中在酵母和動物內臟中含量較高。GSH在臨床領域也上發揮著廣泛的作用，在肝病、腎病以及心血管疾病上都具有顯著的療效。

GSH的主要特征是由于其具有一個γ酰胺鍵和一個巰基基團。在大多數原核和真核生物中由兩步反應生成，第一步由谷氨酸和半胱氨酸在GSH1的作用下生成谷氨酰半胱氨酸，之后該產物再與甘氨酸在GSH2的作用下反應生成GSH，第一步反應的酶是生成GSH的關鍵酶，受產物的反饋抑制，兩步酶皆是ATP依賴型，反應均需消耗1分子的ATP。

已報道的GSH合成方法有化學合成法、酶轉化法和發酵法?；瘜W合成法采用三種原料利用化學工藝合成GSH，成本高昂，且對環境有污染。酶法采用三種原料、ATP及酶反應生成GSH，此法核心是篩選出具有高活性的合成酶，但成本高，目前大多還在研究中。發酵法是微生物利用廉價的原料來生長積累高濃度的GSH，之后進行下一步的分離純化。成本低、純度高、無污染，是目前生產GSH的主要方法。

為此，已經嘗試利用多種微生物實現對GSH的生產。在此方面的研究中，前人經常采用誘變或者基因工程來提高酶的活性，或者通過優化發酵條件提高前體的利用。由于酵母中GSH含量較高，遺傳背景清晰，所以經常被用作生產GSH的優良宿主。目前主要工業生產以發酵法為主，生產宿主為酵母、大腸等。畢赤酵母由于具有食品安全級微生物的狀態，且外源表達以整合為主，無需高昂的誘導劑，成為高密度發酵生產外源蛋白以及其他生物產品的優良宿主。

限制GSH的發酵產量的因素有三個，GSH合成酶的活性、半胱氨酸及ATP的供應。半胱氨酸可以通過外源添加補充，但過量的半胱氨酸會導致合成時期ATP的供應不足。

Alfafara等研究發現半胱氨酸(Cys)是提高GSH的關鍵氨基酸。但在進行高密度發酵生產時，細胞通過代謝合成的Cys遠不能滿足合成GSH的需要。因此外源添加Cys是一種有效策略，而且也確實得到了GSH的大規模生產。然而當Cys過量添加時，使得充當能量載體的ATP成為GSH生產的限制因素。為解決此問題，Liang等通過直接添加ATP使GSH產量提高11％，ATP屬于昂貴原料，放大生產不現實。又如Wang等研究利用檸檬酸鹽作為輔能量底物促進NADH的產生，進而通過電子傳遞鏈加強ATP的產生，使菌株SAM和GSH產量及其聯產產量提高27.5％，然而這種方法不能提高足夠的ATP來滿足高GSH的生產需要。

利用傳統代謝工程提高ATP的供給對于高耗能反應的進行是良好的策略。據報道，在畢赤酵母表達VHB蛋白，增加菌體攝氧能力，進而提高ATP的供應，使得SAM的產量相較對照提高19倍。Tani等發現來自釀酒酵母的ADK是AMP轉化至ATP的限速步驟，后來在Harit利用畢赤酵母產SAM的研究中也得到了證實。

綜上，ATP是谷胱甘肽合成的主要限制因子，如何提高ATP的供應，有效提升谷胱甘肽的產量，是本領域亟需解決的技術問題。

發明內容