[發明專利]一種精準抗體核酸定向連接方法

在審

• 申請號: 202110010916.5
• 申請日: 2021-01-06
• 公開（公告）號: CN112778426A
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 門冬;曹姍姍;周昆;周娟;張先恩
• 申請（專利權）人: 深圳伯生生物傳感技術有限公司;中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12Q1/686
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 孫艷敏

本發明公開了一種精準抗體核酸定向連接方法，包括以下步驟：(1)HUH類核酸內切酶與Protein G通過柔性Linker分子連接，獲得融合蛋白；(2)合成單鏈DNA，其含有能被HUH類核酸內切酶識別的位點；(3)融合蛋白與單鏈DNA混合反應得蛋白核酸復合物；(4)蛋白核酸復合物與目標抗體混合，光照催化條件下反應實現目標抗體與單鏈DNA的定向連接；步驟(1)和(2)可互換；Protein G基因特定位點插入光誘導位點特異性交聯的非天然氨基酸的密碼子。該方法無需對抗體與核酸進行任何化學或功能修飾，不影響抗體識別抗原的能力以及核酸分子的性質與功能；且獲得的抗體核酸復合物一個抗體上僅連有一個核酸分子。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種精準抗體核酸定向連接方法。

背景技術

免疫分析通過特異性免疫識別將目標分子的信息轉化為可定量判讀的信號，被廣泛應用于蛋白質的定性與定量檢測，是臨床診斷、微生物檢測和食品檢測等領域的重要分析方法。然而，傳統免疫分析方法受限于酶分子的催化活性，對于一些微量分析物，如細胞表面稀有受體、循環系統痕量疾病標志物等，難以實現高靈敏、精準定量的分析。免疫PCR是1992年由加利福尼亞大學Sano教授建立的高靈敏分析方法，其將免疫識別的高特異性和核酸擴增的高靈敏度結合起來，成為當前靈敏度最高的的免疫分析方法。

免疫PCR的核心技術環節是將抗體和核酸連接起來，現有的連接技術主要可分為非共價連接和共價連接兩大類。非共價連接體系主要包括有基于鏈霉親和素和生物素相互作用的非共價連接、基于NTA和組氨酸相互作用的非共價連接、基于適配體和配體相互作用的非共價連接以及基于抗體結合蛋白和抗體相互作用的非共價連接等。共價連接體系主要包括有化學交聯、表達蛋白連接介導的DNA和抗體的連接、DNA模板介導的抗體和DNA的連接以及酶促連接等。但這些連接方法建立在隨機化學交聯的基礎上，其交聯效率低、分子活性損失明顯且無法實現化學計量比可控的連接產物，這明顯限制了免疫PCR技術的應用。因此，針對痕量免疫分析技術的迫切需求，亟需發展一種高效、穩定、精確化學計量比的抗體核酸連接技術。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術中抗體和核酸現有連接技術交聯效率低、分子活性損失明顯、化學計量比不可控的問題，提供一種高效、穩定、精確化學計量比的抗體核酸連接技術。

本發明的技術方案如下：

本發明提供的精準抗體核酸定向連接方法，其包括以下步驟：

（1）HUH類核酸內切酶與Protein G通過柔性Linker分子連接，獲得融合蛋白；

（2）合成單鏈DNA，其含有能被HUH類核酸內切酶識別的位點；

（3）融合蛋白與單鏈DNA混合，在二價金屬離子存在下反應得蛋白核酸復合物；

（4）蛋白核酸復合物與目標抗體混合，光照催化條件下反應，蛋白核酸復合物中Protein G和目標抗體的重鏈區Fc段定向交聯，實現目標抗體與單鏈DNA的定向連接；

其中，步驟（1）和（2）不分先后順序；

所述Protein G的基因序列需要在一個特定位點插入光誘導位點特異性交聯的非天然氨基酸的密碼子進行修飾；

所述HUH類核酸內切酶即指具有組氨酸-疏水結構域-組氨酸結構的核酸內切酶，可以選自TYLCV、TOPO Ⅰ、IS608、A*或Tra Ⅰ。

其中，作為一種可選的具體實施方案，步驟（1）中融合蛋白的獲得，可以先將HUH類核酸內切酶基因與Protein G基因通過Linker基因融合在一起，然后克隆到載體上，再表達出融合蛋白。

可選或優選的，上述連接方法中，

當HUH類核酸內切酶為TYLCV時，步驟（2）的單鏈DNA含有CAACTTGATA（SEQ ID NO:1）的序列；

當HUH類核酸內切酶為TOPO Ⅰ時，步驟（2）的單鏈DNA含有CCCTT的序列；