[發(fā)明專利]一種精準抗體核酸定向連接方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110010916.5
• 申請日: 2021-01-06
• 公開（公告）號: CN112778426A
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發(fā)明（設計）人: 門冬;曹姍姍;周昆;周娟;張先恩
• 申請（專利權）人: 深圳伯生生物傳感技術有限公司;中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12Q1/686
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 孫艷敏

1.一種精準抗體核酸定向連接方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)HUH類核酸內切酶與Protein G通過柔性Linker分子連接，獲得融合蛋白；

(2)合成單鏈DNA，其含有能被HUH類核酸內切酶識別的位點；

(3)融合蛋白與單鏈DNA混合，在二價金屬離子存在下反應得蛋白核酸復合物；

(4)蛋白核酸復合物與目標抗體混合，光照催化條件下反應，蛋白核酸復合物中Protein G和目標抗體的重鏈區(qū)Fc段定向交聯，實現目標抗體與單鏈DNA的定向連接；

其中，步驟(1)和(2)不分先后順序；

所述Protein G的基因序列需要在至少一個特定位點插入光誘導位點特異性交聯的非天然氨基酸的密碼子進行修飾；

所述HUH類核酸內切酶選自TYLCV、TOPOⅠ、IS608、A*或TraⅠ。

2.根據權利要求1所述的連接方法，其特征在于，

當HUH類核酸內切酶為TYLCV時，步驟(2)的單鏈DNA含有CAACTTGATA的序列；

當HUH類核酸內切酶為TOPOⅠ時，步驟(2)的單鏈DNA含有CCCTT的序列；

當HUH類核酸內切酶為IS608時，步驟(2)的單鏈DNA含有TATGTTAC的序列；

當HUH類核酸內切酶為A*時，步驟(2)的單鏈DNA含有CAACTTGATAT的序列；

當HUH類核酸內切酶為TraⅠ時，步驟(2)的單鏈DNA含有GTTTTTGCGTGGGGTGT的序列。

3.根據權利要求2所述的連接方法，其特征在于，步驟(3)中的二價金屬離子滿足以下要求：

當HUH類核酸內切酶為TYLCV時，二價金屬離子濃度為4mM；

當HUH類核酸內切酶為TOPOⅠ時，二價金屬離子濃度為1mM；

當HUH類核酸內切酶為IS608時，二價金屬離子濃度為20mM；

當HUH類核酸內切酶為A*時，二價金屬離子濃度為4mM；

當HUH類核酸內切酶為TraⅠ時，二價金屬離子濃度為4mM。

4.根據權利要求1所述的連接方法，其特征在于，步驟(3)中反應條件為36～38℃，反應時間為25～35min。

5.根據權利要求1所述的連接方法，其特征在于，步驟(3)所得產物還經過陰離子交換柱HiTrap Q HP進行分離純化。

6.根據權利要求1所述的連接方法，其特征在于，所述Protein G基因序列的特定位點選自12位亮氨酸、18位蘇氨酸、20位丙氨酸、23位丙氨酸、26位丙氨酸、28位精氨酸或32位谷氨酰胺。

7.根據權利要求1所述的連接方法，其特征在于，所述的非天然氨基酸為L-對苯甲酰基苯丙氨酸，密碼子為琥珀密碼子TAG。

8.根據權利要求1所述的連接方法，其特征在于，步驟(4)的光照條件為365nm紫外光照射。

9.根據權利要求1所述的連接方法，其特征在于，步驟(4)光照催化反應結束后還經過鎳親和層析進行產物純化。

10.一種用于免疫PCR的檢測抗體復合物，其特征在于，包括目標抗體和單鏈DNA，該目標抗體通過連接蛋白與單鏈DNA共價連接，所述連接蛋白為通過柔性Linker分子連接在一起的HUH類核酸內切酶與Protein G；其中

單鏈DNA含有能被HUH類核酸內切酶識別的位點；

連接蛋白中Protein G與目標抗體的Fc段共價交聯。