[發明專利]一種運用數字PCR進行胎兒分數檢測的方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 202110007527.7
• 申請日: 2021-01-05
• 公開（公告）號: CN112899357A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 尚午;王友祥;楊志劼
• 申請（專利權）人: 南京普濟生物有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供一種運用數字PCR進行胎兒分數檢測的方法及其試劑盒，通過提取樣本中的DNA，從孕婦外周血中提取DNA；然后將樣品DNA、多重PCR反應酶和目標基因的引物混勻后，進行數字PCR反應，針對目標基因采用的數字PCR反應引物包含三維結構，所述數字PCR使用的引物包含不少于十個堿基的特殊核酸序列N，所述特殊核酸序列N只由腺嘌呤、鳥嘌呤和胸腺嘧啶組成；通過目標基因的部分序列在孕婦外周血和胎兒胎盤細胞中存在超甲基化狀態或低甲基化狀態來進行胎兒分數的檢測。本發明提供運用數字PCR進行胎兒分數檢測的方法及其試劑盒，采用超多重數字PCR的技術手段，無非特異性擴增，特異性好，所述的方法及試劑盒突出了實驗效果、結果分析簡便，周期短的優勢。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種運用數字PCR進行胎兒分數檢測的方法及其試劑盒。

背景技術

自孕婦外周血中發現游離胎兒DNA以來，研究人員對其展開大量研究，發展出基于二代測序技術的無創產前檢測技術，此技術比傳統唐氏綜合征血清學篩查更準確，比羊水穿刺更安全。由于無創產前檢測技術無創、安全和準確，受到醫生和孕婦的認可并被臨床快速接受，是目前二代測序技術最為成功的臨床應用。然而，NIPT結果的準確度受母親外周血中胎兒DNA占比情況影響非常大，目前沒有合適的技術檢測胎兒分數。

因此，有必要提供一種新的技術方案以克服現有的胎兒分數檢測中存在的技術障礙。

發明內容

為解決現有技術存在的問題，本發明提供一種運用數字PCR進行胎兒分數檢測的方法及其試劑盒，應用特殊的緩沖液和引物，通過超多重數字PCR路徑實現對母親外周血中游離DNA中胎兒特異性基因位點的擴增，實現胎兒游離DNA在母親游離DNA中的占比計算。

本發明提供一種運用數字PCR進行胎兒分數檢測的方法，包括以下步驟：

步驟一、提取樣本中的DNA：從孕婦外周血中提取DNA，得到樣品DNA；

步驟二、將步驟一得到的樣品DNA、多重PCR反應酶和目標基因的引物混勻后，進行數字PCR反應；

其中，所述目標基因的部分序列在孕婦外周血和胎兒胎盤細胞中存在超甲基化狀態或低甲基化狀態；所述目標基因的引物包含以下堿基序列：

GGGUUGGGAAGAAACUGUGGCACUUCGGUGCCAGCAACCC；

在所述數字PCR反應中，所述目標基因的引物包含三維結構，所述目標基因的引物包含不少于十個堿基的特殊核酸序列N，所述特殊核酸序列N只由腺嘌呤、鳥嘌呤和胸腺嘧啶組成。

通過上述技術方案，應用特殊的和引物，通過超多重數字PCR路徑實現對母親外周血中游離DNA中胎兒特異性基因位點的擴增，實現胎兒分數的檢測。

優選地，在如前所述的方法中，所述目標基因的部分序列在孕婦外周血和胎兒胎盤細胞的甲基化狀態不同。通過該技術方案，應用特殊的引物，通過超多重數字PCR路徑實現對母親外周血中游離DNA中胎兒特異性基因位點的擴增，實現胎兒游離DNA在母親游離DNA中的占比計算，實現胎兒分數的檢測。

優選地，在如前所述的方法中，所述數字PCR反應所采用的反應液不包含三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸組分。通過該技術方案，應用特殊的緩沖液和引物，通過超多重數字PCR路徑實現對母親外周血中游離DNA中胎兒特異性基因位點的擴增，實現胎兒游離DNA在母親游離DNA中的占比計算，實現胎兒分數的檢測。

優選地，在如前所述的方法中，步驟二所述數字PCR使用了至少十對引物，同時進行目標基因的檢測。通過該技術方案，應用特殊的緩沖液和引物，通過超多重數字PCR路徑實現對母親外周血中游離DNA中胎兒特異性基因位點的擴增，實現胎兒游離DNA在母親游離DNA中的占比計算，實現胎兒分數的檢測。