[發(fā)明專利]一種基于湖泊濕地eDNA提取技術(shù)監(jiān)測濕地野生脊椎動(dòng)物多樣性的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110007281.3
• 申請(qǐng)日: 2021-01-05
• 公開（公告）號(hào): CN112608987A
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳富勤;溫慶忠;華朝朗;蔡望;楊春燕;宋勁忻
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院;中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869
• 代理公司: 北京匯捷知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11531
• 代理人: 臧冰

本發(fā)明公開了一種基于湖泊濕地eDNA提取技術(shù)監(jiān)測濕地野生脊椎動(dòng)物多樣性的方法，包括如下步驟：(1)樣品采集：取待測湖泊濕地的表層水樣；(2)eDNA提?。簩⑺〉乃畼舆M(jìn)行處理，提取eDNA；(3)eDNA的PCR過程；(4)eDNA技術(shù)的PCR產(chǎn)物純化與定量；(5)高通量測序；(6)生物信息學(xué)分析；(7)分類鑒定，確定待測湖泊濕地中脊椎動(dòng)物多樣性組成。本發(fā)明無需調(diào)查者具有傳統(tǒng)的生物識(shí)別及鑒定經(jīng)驗(yàn)，取樣簡單、檢測方便，省時(shí)省力、成本低、檢測效率高且不會(huì)對(duì)濕地生物造成傷害，有利于濕地生物多樣性保護(hù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及濕地生物多樣性監(jiān)測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于湖泊濕地eDNA提取技術(shù)監(jiān)測濕地野生脊椎動(dòng)物多樣性的方法。

背景技術(shù)

濕地具有保持水源、凈化水質(zhì)、蓄洪防旱、調(diào)節(jié)氣候和維護(hù)水生生物多樣性等重要生態(tài)功能，在維護(hù)自然生態(tài)系統(tǒng)平衡的過程起著極為重要的作用。建立長期有效的濕地生物多樣性監(jiān)測機(jī)制，記錄濕地生物多樣性的現(xiàn)狀，評(píng)估其未來的演變趨勢，是理解生物多樣性變化驅(qū)動(dòng)力的基礎(chǔ)，也是制定合理的生物多樣性保護(hù)策略的重要前提(馬克平,2011；Pereira et al.,2013)。

濕地野生脊椎動(dòng)物包含魚類、鳥類、爬行類、兩棲類、哺乳類。傳統(tǒng)的監(jiān)測方法主要通過不同季度或者年份野外調(diào)查，同時(shí)要求調(diào)查者具有傳統(tǒng)的生物識(shí)別及鑒定經(jīng)驗(yàn)，人員、經(jīng)費(fèi)投入大、耗時(shí)且對(duì)調(diào)查對(duì)象造成一定損害。

環(huán)境DNA(environmental DNA，eDNA)是各種生物體脫落釋放于環(huán)境中的混合DNA總稱。eDNA metabarcoding是指從環(huán)境樣品(如水、土壤等)中直接提取到的DNA進(jìn)行高通量的多個(gè)物種鑒定方法。該技術(shù)整合DNA條形碼和高通量測序技術(shù)，通過提取環(huán)境樣品中的DNA，并使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序后得到的可操縱分類單元(operational taxonomic units,OTUs)進(jìn)行物種鑒定(Ji et al.,2013)。

專利號(hào)為CN109825563A的中國發(fā)明專利于2019年5月31日公開的用于一種基于環(huán)境DNA技術(shù)檢測魚類物種多樣性的方法，包括以下步驟：

(1)取待測水域的表層水樣；

(2)將所取的水樣進(jìn)行處理，提取eDNA；

(3)以提取的eDNA為模板，CytbF(序列如SEQ ID NO:1)和Cytb R(序列如SEQ IDNO:2)、16S F(序列如SEQ ID NO:3)和16SR(序列如SEQ ID NO:4)為引物，PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；

(4)回收、純化目的片段，構(gòu)建目的片段文庫，進(jìn)行高通量測序后的原始數(shù)據(jù)優(yōu)化后獲得高質(zhì)量序列；

(5)OTU聚類：應(yīng)用軟件Vsearch2.3.4對(duì)高質(zhì)量序列在97％的相似性水平上進(jìn)行聚類，產(chǎn)生可操作性分類單元(operational taxonomic units,OTUs)；

(6)建立魚類比對(duì)數(shù)據(jù)庫；

(7)OTUs代表性序列與建立的魚類數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)信息進(jìn)行比對(duì)分析，確定待測水域中魚類的物種多樣性組成。

傳統(tǒng)的濕地生物多樣性監(jiān)測要求調(diào)查者具有傳統(tǒng)的生物識(shí)別及鑒定經(jīng)驗(yàn)，且需要聘請(qǐng)多學(xué)科的專業(yè)調(diào)查人員，如魚類、鳥類、兩棲類等具有多年調(diào)查經(jīng)驗(yàn)的相關(guān)專家，聘請(qǐng)專家費(fèi)用造成成本高；針對(duì)一個(gè)區(qū)域濕地的傳統(tǒng)野外調(diào)查，效率底，耗時(shí)間，如湖泊濕地野生脊椎動(dòng)物多樣性調(diào)查，需要具有傳統(tǒng)分類經(jīng)驗(yàn)的魚類專家、兩棲類、鳥類等專家，長期進(jìn)行野外調(diào)查，而本專利涉及野外采樣僅需1天，且不會(huì)對(duì)野生脊椎動(dòng)物及其棲息地造成不利影響。此外，專利號(hào)為CN109825563A僅對(duì)一個(gè)類群(魚類)進(jìn)行檢測，且引物設(shè)計(jì)2對(duì)，檢出率不高，而本專利魚類僅設(shè)計(jì)1對(duì)引物；且該專利僅檢測濕地中魚類，對(duì)濕地其它脊椎動(dòng)物，如鳥類、兩棲類等并沒檢測，檢測效率低。