[發明專利]一種基于湖泊濕地eDNA提取技術監測濕地野生脊椎動物多樣性的方法

在審

• 申請號: 202110007281.3
• 申請日: 2021-01-05
• 公開（公告）號: CN112608987A
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 吳富勤;溫慶忠;華朝朗;蔡望;楊春燕;宋勁忻
• 申請（專利權）人: 云南省林業調查規劃院;中國科學院昆明動物研究所
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 臧冰

1.一種基于湖泊濕地eDNA提取技術監測濕地野生脊椎動物多樣性的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)樣品采集：取待測湖泊濕地的表層水樣；

(2)eDNA提取：將所取的水樣進行處理，提取eDNA；

(3)eDNA的PCR過程；

(4)eDNA技術的PCR產物純化與定量；

(5)高通量測序；

(6)生物信息學分析；

(7)分類鑒定，確定待測濕地中脊椎動物的物種多樣性組成。

2.根據權利要求1所述的基于湖泊濕地eDNA提取技術監測濕地野生脊椎動物多樣性的方法，其特征在于：在步驟(1)中，樣品采集

準備：每個地點需要使用到的采樣工具在使用前經過高溫高壓滅菌處理后，獨立包裝，一次性使用，不可重復；

選點：在每一個監測點用聚乙烯玻璃采水器取表層水樣，由湖岸向湖心每隔10～20m取1L水樣，共選取10至20個點，即10～20L水，并用0.45μm的硝酸纖維濾膜過濾采集的水樣；

在步驟(2)中，eDNA提取

Step1用蠕動泵將濾器中的酒精泵出濾器，然后將濾器放在無菌操作臺里干燥24h；

Step2 24h候后將濾器取出，加入20ml的消化混合液；

Step3震蕩混勻后再次將濾器密封，放入恒溫箱56℃孵化48h，期間每隔12h翻動一次；

Step4取出濾器，將濾器中的消化液從上口倒入一個全新的50ml離心管中，9000轉離心半分鐘，轉移上清液至一新的50ml離心管中；

Step5加入等體積的ALbuffer入50ml離心管中，混勻；

Step6加入等體積的無水乙醇至50ml離心管中，混勻，并將液體逐量轉移至離心柱中；

Step7按照DNA提取試劑盒標準流程進行提取；

Step8提取完的DNA樣本于實驗室-20℃保存。

3.根據權利要求1所述的基于湖泊濕地eDNA提取技術監測濕地野生脊椎動物多樣性的方法，其特征在于：在步驟(1)中，用專利號為CN 209178386U的中國發明專利于2019年7月30日公開的孔徑為0.45μm的硝酸纖維濾膜囊式過濾器過濾采集的水樣，過濾完成后，灌入約50ml的無水乙醇，然后將兩端出水口與進水口密封，將每個濾器放入自封袋獨立保存，盡可能低溫運輸回實驗室，并且記錄采樣時間，GPS點，采樣水量；

在步驟(2)中，step2消化混合液中的混合蛋白酶k:ATL的比例為1:9。

4.根據權利要求1所述的基于湖泊濕地eDNA提取技術監測濕地野生脊椎動物多樣性的方法，其特征在于：在步驟(4)中，PCR割膠純化使用QIAquick Gel Extraction Kit試劑盒，磁珠純化使用KAPA Pure Beads磁珠，Qubit定量使用Qubit 2.0定量儀和Qubit dsDNA HSAssay Kit試劑盒。

5.根據權利要求1所述的基于湖泊濕地eDNA提取技術監測濕地野生脊椎動物多樣性的方法，其特征在于：在步驟(5)中，使用MiSeq二代測序儀。

6.根據權利要求1所述的基于湖泊濕地eDNA提取技術監測濕地野生脊椎動物多樣性的方法，其特征在于：在步驟(6)中，Step1原始數據處理，Step2可操作分類單元(OTU)的聚類，Step3分類鑒定。

7.根據權利要求6所述的基于湖泊濕地eDNA提取技術監測濕地野生脊椎動物多樣性的方法，其特征在于：在步驟(6)中，原始數據處理：

①使用Adapter Removal v.2.2((Schubert et al.,2016)去除可能殘留的Illumina測序接頭序列；②使用Sickle v.1.3.3(Joshi andFass,2011)去掉低質量的堿基；③使用SPAdes3.10.1(Nikolenko et al.,2013)進行序列糾錯；④使用PANDAseq v.2.11(Masellaet al.,2012)將上述處理后的雙向序列進行拼接。