[發明專利]一種端粒和著絲粒超分辨成像方法及其探針

在審

• 申請號: 202110006799.5
• 申請日: 2021-01-04
• 公開（公告）號: CN112592963A
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 宗慎飛;葉翔宇;王著元;崔一平
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 徐激波

本發明公開了一種端粒和著絲粒超分辨成像方法及其探針，其中所述端粒DNA探針，其序列中包含3個重復單元，所述重復單元的序列如SEQ ID NO.1所示，所述端粒DNA探針和所述著絲粒DNA探針的5’端具有熒光分子，借助探針DNA序列的可逆結合，通過細胞固定、RNA消化、細胞脫水、雜交、清洗和成像的步驟，利用全內反射照明實現兩種探針熒光信號的開和關，實現端粒和著絲粒的超分辨單分子定位成像，具有實驗成本低、周期短、特異性好、準確度的優點。

技術領域

本發明涉及DNA雜交與光學超分辨成像，主要涉及一種端粒和著絲粒超分辨成像方法及其探針。

背景技術

端粒是位于真核細胞線性染色體末端的一小段DNA-蛋白質復合體，是短的多重復的非轉錄序列(TTAGGG)及一些結合蛋白組成特殊結構，起到保護染色體DNA的末端，避免染色體DNA的降解、末端融合以及非正常重組等作用。對于哺乳動物而言，端粒的存在可以維持染色體末端穩定，端粒的長度會隨著細胞分裂次數的增加而不斷縮短，從而確保細胞內的DNA以及遺傳信息能夠穩定完整的存在。但是，隨著端粒的不斷縮短，會致使細胞內的基因組無法維持在穩定狀態，最終導致細胞老化、死亡或癌變。因此，測量端粒成像有助于提供與疾病相關的重要信息。

目前已有的端粒和著絲粒成像方法主要有：電子顯微鏡成像、熒光染色配合光學顯微鏡成像等。電子顯微鏡的分辨率可以達到0.1nm，能夠以極高的分辨率展現樣品的細節。但是電子顯微鏡也存在各種問題，主要在于電鏡的樣品制備過程極為復雜苛刻，并且電鏡只能看到細胞內部的結構，對于結構的判斷需要其他技術輔助辨別。過去，研究人員也使用光學顯微鏡對端粒進行了成像，該方法通過各種熒光染色方法，可以標記特定的細胞甚至分子。但是，由于光學顯微鏡的分辨率受光波通過小孔徑或聚焦到微小點時的衍射或“散布”的限制，該方法只能以數百納米的中等分辨率對端粒和著絲粒進行成像，而不能實現單分子水平的成像。

這些方法在端粒研究中有很重要的貢獻，但它們都存在不足，如靈敏度低、程序復雜、成本高、分辨率不足等，因此需要設計出具有高靈敏度、高準確性、廣泛適用性的端粒和著絲粒成像技術。

基于單分子定位的超分辨熒光顯微成像(SMLM)包括光激活定位成像(PALM)與隨機光學重構超分辨成像(STORM)，將有機熒光探針與超分辨光學顯微成像技術緊密結合在一起，有機熒光探針為研究其超分辨成像提供了有力的工具。

利用DNA鏈的互補性產生類似于熒光分子閃爍的效果也可進行SMLM成像。通過調整DNA鏈的結合強度和濃度，可以反復產生瞬時結合，獲得類似STORM中熒光染料的熒光閃爍現象。對獲得的數據進行重建，就可以得到超分辨率圖像。

發明內容

發明目的：為解決目前測量端粒超分辨成像方法操作復雜、靈敏度不高、成本高的問題，本發明提供了一種端粒和著絲粒超分辨成像方法及其探針，借助DNA序列的可逆結合實現端粒和著絲粒的超分辨單分子定位成像(SMLM)。

技術方案：為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：一種端粒和著絲粒超分辨成像方法，其包括如下步驟，(1)向接種有待測細胞的細胞培養板中加入固定劑固定好細胞，進行細胞膜穿透；(2)加入RNA抑制劑，進行RNA消化；(3)加入胃蛋白酶使蛋白質分解；(4)加入乙醇使細胞梯度脫水；(5)將端粒DNA探針、著絲粒DNA探針與雜交緩沖液制作成探針溶液，其中所述端粒DNA探針，其序列中包含3個重復單元，所述重復單元的序列如SEQ IDNO.1所示，所述端粒DNA探針和所述著絲粒DNA探針的5’端具有熒光分子；(6)將探針溶液加入到八孔板中進行雜交；(7)利用全內反射照明模式采集細胞上的端粒和著絲粒熒光信號，進行熒光圖像的采集和超分辨單分子定位成像。

優選的，所述熒光分子包括Cy3、Cy5中的一種或幾種。

優選的，所述端粒DNA探針的序列如SEQ ID NO.2所示，所述著絲粒DNA探針的序列如SEQ ID NO.3所示。