[發明專利]一種端粒和著絲粒超分辨成像方法及其探針

在審

• 申請號: 202110006799.5
• 申請日: 2021-01-04
• 公開（公告）號: CN112592963A
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 宗慎飛;葉翔宇;王著元;崔一平
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 徐激波

1.一種端粒和著絲粒超分辨成像方法，其特征在于：包括如下步驟，

(1)向接種有待測細胞的細胞培養板中加入固定劑固定好細胞，進行細胞膜穿透；

(2)加入RNA抑制劑，進行RNA消化；

(3)加入胃蛋白酶使蛋白質分解；

(4)加入乙醇使細胞梯度脫水；

(5)將端粒DNA探針、著絲粒DNA探針與雜交緩沖液制作成探針溶液，其中所述端粒DNA探針，其序列中包含3個重復單元，所述重復單元的序列如SEQ ID NO.1所示，所述端粒DNA探針和所述著絲粒DNA探針的5’端具有熒光分子；

(6)將探針溶液加入到八孔板中進行雜交；

(7)利用全內反射照明模式采集細胞上的端粒和著絲粒熒光信號，進行熒光圖像的采集和超分辨單分子定位成像。

2.如權利要求1所述的端粒和著絲粒超分辨成像方法，其特征在于：所述熒光分子包括Cy3、Cy5中的一種或幾種。

3.如權利要求2所述的端粒和著絲粒超分辨成像方法，其特征在于：所述端粒DNA探針的序列如SEQ ID NO.2所示，所述著絲粒DNA探針的序列如SEQ ID NO.3所示。

4.如權利要求1-3任一項所述的端粒和著絲粒超分辨成像方法，其特征在于：步驟(1)，所述固定劑包括4％多聚甲醛，所述固定的時間大于20min；所述進行細胞膜穿透，其為用0.2％曲拉通(TritonX-100)透膜，時間大于5min；步驟(2)中，所述RNA抑制劑為PBS配置的RNaseA溶液，濃度為100μg/mL，反應時間大于20min；步驟(3)中，所述胃蛋白酶為濃度0.005％(w/v)的胃蛋白酶溶液，使用濃度為10mM的稀鹽酸配制，配制前將稀鹽酸加熱到37℃，使用前將胃蛋白酶溶液預熱至45℃，所述分解的溫度為37℃，分解時間大于5min；步驟(4)中，所述梯度脫水其為先后分別使用濃度為70％、85％、100％(v/v)的冰乙醇進行；步驟(5)中，所述雜交緩沖液的配方為：20mMTris-HCl，PH7.4，60％(v/v)甲酰胺，0.1μg/mL鮭魚精DNA；步驟(6)中，所述雜交需在避光條件下進行，雜交溫度為37℃，雜交時間為3小時，

5.如權利要求1-3任一項所述的端粒和著絲粒超分辨成像方法，其特征在于：步驟(8)中，所述采集細胞上的端粒和著絲粒熒光信號，其利用激發光波長分別為647nm、561nm，收集＞561nm和＞642nm的熒光信號，所述進行熒光圖像的采集，其圖像曝光時間50毫秒，采集至少3000幀。

6.一種用于端粒和著絲粒超分辨成像的探針，其特征在于：探針的5’端具有熒光分子，所述熒光分子包括Cy3、Cy5中的一種或幾種；

所述探針包括端粒DNA探針和著絲粒DNA探針，所述端粒DNA探針的序列中包含3個重復單元，所述重復單元的序列如SEQ ID NO.1所示。

7.如權利要求6所述的用于端粒和著絲粒超分辨成像的探針，其特征在于：所述端粒DNA探針的序列如SEQ ID NO.2所示，所述著絲粒DNA探針的序列如SEQ ID NO.3所示。