[發明專利]檢測血液中維生素K2(MK-7)含量的方法

有效

• 申請號: 202110006256.3
• 申請日: 2021-01-05
• 公開（公告）號: CN112834681B
• 公開（公告）日: 2023-09-12
• 發明（設計）人: 邱天祎;賈永娟;許麗;倪君君
• 申請（專利權）人: 北京和合醫學診斷技術股份有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 北京開陽星知識產權代理有限公司 11710
• 代理人: 丁繼恩

1.檢測血液中維生素K2(MK-7)含量的方法，其特征在于，包括：

利用高效液相色譜串聯質譜儀，在一定檢測條件下，分別檢測至少三個標準溶液，得到各個標準溶液的色譜圖，其中，任一標準溶液中均含有濃度已知的維生素K2(MK-7)標準品及內標物，不同標準溶液中維生素K2(MK-7)標準品的濃度不同；所述內標物采用維生素K2(MK-7)-d7；根據各個標準溶液的色譜圖，擬合得到維生素K2(MK-7)的標準曲線方程；

將一定量的內標工作液和一定量的血液樣本混勻，然后加入一定量的無水乙醇并混勻，再加入一定量的正己烷并混勻，離心取上清液，通過氮吹的方式吹干上清液，吹干后加入一定量的稀釋液并混勻，離心取上清液得到待測樣本，其中，該血液樣本為經處理至少100μL待檢測血液而得到的血清或血漿，內標工作液中含有濃度已知的內標物，稀釋液為含0～0.1％甲酸和5～20％水的乙腈溶液；

利用高效液相色譜串聯質譜儀，在相同檢測條件下檢測待測樣本，得到待測樣本的色譜圖；所述檢測條件中的液相條件包括：PhenomenexKinetexF5色譜柱，色譜柱的長度為100min、內徑為2.1mm、填料粒徑為1.7μm，流動相A為含0.5％甲酸的水溶液，流動相B為甲醇與乙腈的混合溶液，該混合溶液中甲醇與乙腈的體積比為1∶4，洗脫過程采用梯度洗脫的方式；流速為0.80mL/min；所述洗脫過程包括：

所述檢測條件中的串聯質譜條件包括：APCI(+)檢測模式，采集模式為MRM，根據待測樣本的色譜圖和維生素K2(MK-7)的標準曲線方程，計算血液樣本中維生素K2(MK-7)的含量。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，

所述將一定量的內標工作液和一定量的血液樣本混勻，然后加入一定量的無水乙醇并混勻，再加入一定量的正己烷并混勻，離心取上清液，通過氮吹的方式吹干上清液，吹干后加入一定量的稀釋液并混勻，離心取上清液得到待測樣本，包括：

用移液槍移取血液樣本50～200μL于一離心管中，然后加入一定量的內標工作液，在1000～500rpm的轉速下渦旋震蕩混合20s～2min；

然后加入無水乙醇0.3～1.0mL，在1000～2500rpm的轉速下渦旋震蕩混合1～4min，再加入正己烷0.5～1.2mL，在1000～2500rpm的轉速下渦旋震蕩混合4～10min，再在10000～12000rpm的轉速下高速離心5～12min，移取上清液至另一離心管中；

用氮氣吹干移取的上清液，吹干后加入50～400μL稀釋液，在1000～2500rpm的轉速下渦旋震蕩混合1～3min，再在10000～14000rpm的轉速下高速離心5～12min，取上清液得到待測樣本。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，

內標工作液中含10～60ng/mL的維生素K2(MK-7)-d7，添加量為10μL。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，柱溫為30～50℃，進樣量為5～50μL。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，

所述檢測條件中的串聯質譜條件包括：氣簾氣壓力為20～55psi，碰撞氣壓力為1～12psi，霧化電流值為1～5μA，離子化溫度為200～750℃，霧化氣壓力為10～90psi；輔助氣壓力為0psi。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，

在所述分別檢測至少三個標準溶液之前，進一步包括：

制備至少三個標準工作液，標準工作液中含有濃度已知的維生素K2(MK-7)標準品，標準工作液中維生素K2(MK-7)標準品的濃度在0.3～153.6ng/mL范圍內，不同標準工作液中維生素K2(MK-7)標準品的濃度不同；

利用移液器移取10μL標準工作液、10μL內標工作液置于離心管中，再移取加入所述稀釋液80μL；

將該離心管在轉速為1000～2500rpm下渦旋混勻0.5～1min后，得到標準溶液。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，各個標準工作液中維生素K2(MK-7)標準品的濃度分別為0.3ng/mL、0.6ng/mL、1.2ng/mL、2.4ng/mL、4.8ng/mL、9.6ng/mL、19.2ng/mL、38.4ng/mL、76.8ng/mL、153.6ng/mL。