[發(fā)明專利]使用斷裂內(nèi)含肽系統(tǒng)的的蛋白質(zhì)純化

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202080080416.2
• 申請日: 2020-11-20
• 公開（公告）號: CN114698379A
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: C·J·塞文斯基;P·倫德貝克;J·奧曼;G·格羅斯曼;S·R·丁
• 申請（專利權(quán)）人: 思拓凡生物工藝研發(fā)有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/62
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 黃登高;彭昶

本發(fā)明涉及主要在層析領(lǐng)域的蛋白質(zhì)純化。更確切地，本發(fā)明涉及使用具有改善的C?內(nèi)含肽標(biāo)簽和N?內(nèi)含肽配體的斷裂內(nèi)含肽系統(tǒng)的親和層析，其中靶蛋白可以作為具有天然N末端的無標(biāo)簽的終產(chǎn)物進(jìn)行純化。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及主要在層析領(lǐng)域的蛋白質(zhì)純化。更確切地，本發(fā)明涉及使用具有改善的C-內(nèi)含肽標(biāo)簽和N-內(nèi)含肽配體的斷裂內(nèi)含肽(split intein)系統(tǒng)的親和層析，其中靶蛋白可以作為具有天然N末端的無標(biāo)簽的終產(chǎn)物進(jìn)行純化。

背景技術(shù)

內(nèi)含肽是作為框內(nèi)插入物表達(dá)的蛋白質(zhì)元件，其中斷酶序列并催化其自身的兩個側(cè)翼多肽的切除和連接，生成活性蛋白質(zhì)。在遺傳上，內(nèi)含肽以兩種不同的方式編碼：作為完整內(nèi)含肽，中斷兩個側(cè)翼外顯肽序列，或作為斷裂內(nèi)含肽，其中每個外顯肽和部分內(nèi)含肽由兩種不同基因編碼。雖然它們作為生物工程和蛋白質(zhì)純化工具具有很大的希望，但在自然界中發(fā)現(xiàn)的具有快速動力學(xué)性質(zhì)的斷裂內(nèi)含肽依賴于在內(nèi)含肽-外顯肽連接處的特定氨基酸，嚴(yán)重限制了可以與內(nèi)含肽融合用于天然蛋白質(zhì)序列的親和純化和回收的蛋白質(zhì)。特別地，來自點形念珠藻的原型斷裂內(nèi)含肽DNAE顯示出適合于蛋白質(zhì)純化應(yīng)用的動力學(xué)性質(zhì)。然而，它的活性依賴于在C-外顯肽中的+2位置處的苯丙氨酸。這種依賴性嚴(yán)重縮小并損害了它的普遍適用性。

內(nèi)含肽已被改造為實現(xiàn)生物技術(shù)中的幾個重要功能，包括作為自切割蛋白質(zhì)用于重組蛋白質(zhì)純化的應(yīng)用。斷裂內(nèi)含肽在這方面是特別有希望的，因為它們可以同時提供親和配體和自切割性質(zhì)。在蛋白質(zhì)純化中，作為純化對象的靶蛋白可以取代任一外顯肽。迄今為止，斷裂內(nèi)含肽的DNAE家族已顯示對于C末端切割蛋白質(zhì)純化方法的最大希望。

WO2014/004336描述了與斷裂內(nèi)含肽N片段和斷裂內(nèi)含肽C片段融合的蛋白質(zhì)，其可以附著至支持物。固體支持物可以是顆粒、珠、樹脂或載玻片。

WO2014/110393描述了與斷裂內(nèi)含肽C片段融合的目的蛋白質(zhì)，使其與斷裂內(nèi)含肽N片段和純化標(biāo)簽接觸。N片段可以經(jīng)由純化標(biāo)簽附著到固相，并且討論了用于親和純化的方法。

US 10 066027描述了蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)和該系統(tǒng)的使用方法。公開的是包含N末端內(nèi)含肽區(qū)段和C末端內(nèi)含肽區(qū)段的斷裂內(nèi)含肽，所述N末端內(nèi)含肽區(qū)段可以是固定的，所述C末端內(nèi)含肽區(qū)段具有自切割性質(zhì)且可以附著至目的蛋白質(zhì)。N末端內(nèi)含肽區(qū)段提供有增強敏感性的基序，所述基序致使其對外在條件更敏感。

US 10 308 679描述了包含N-內(nèi)含肽多肽和N-內(nèi)含肽溶解配偶體的融合蛋白，以及包含此類融合蛋白的親和基質(zhì)。

WO 2018/091424描述了用于生產(chǎn)親和層析樹脂的方法，所述親和層析樹脂包含氨基末端(N末端)的斷裂內(nèi)含肽片段作為親和配體，所述方法包括下述步驟：a)在細(xì)菌細(xì)胞優(yōu)選大腸桿菌中，作為包涵體中的不溶性蛋白質(zhì)表達(dá)N末端的斷裂內(nèi)含肽片段蛋白質(zhì)，b)收獲所述包涵體；c)使所述包涵體溶解并釋放所表達(dá)的蛋白質(zhì)；d)在固體支持物上結(jié)合所述蛋白質(zhì)；e)使所述蛋白質(zhì)重折疊；f)從固體支持物中釋放所述蛋白質(zhì)；并且g)將所述蛋白質(zhì)作為配體固定到層析樹脂上，以形成親和層析樹脂。該程序使得能夠固定2-10 mg/ml樹脂的配體密度。

如上所述，已使用組合的親和標(biāo)簽和標(biāo)簽切割機制，將斷裂內(nèi)含肽用于蛋白質(zhì)純化。然而，此類系統(tǒng)的效用受到幾個因素的限制。首先，在預(yù)期產(chǎn)物的剪接點處存在氨基酸需求，即需要在C-外顯肽的+2位置中的Phe，以進(jìn)行切割和實現(xiàn)無標(biāo)簽蛋白質(zhì)的純化。在N末端上沒有外來氨基酸的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)是高度期望的。其次，釋放蛋白質(zhì)的切割必須足夠快速并提供可接受的產(chǎn)率。第三，存在斷裂內(nèi)含肽N或C片段的溶解度需求，用于其附著至固體支持物。第四，迄今為止不存在適合于無標(biāo)簽蛋白質(zhì)的大規(guī)模純化的可用斷裂內(nèi)含肽系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，并且能夠使用斷裂內(nèi)含肽系統(tǒng)，在僅一個快速親和層析步驟中，對無標(biāo)簽/天然蛋白質(zhì)進(jìn)行通用純化。