[發明專利]使用斷裂內含肽系統的的蛋白質純化

在審

• 申請號: 202080080416.2
• 申請日: 2020-11-20
• 公開（公告）號: CN114698379A
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: C·J·塞文斯基;P·倫德貝克;J·奧曼;G·格羅斯曼;S·R·丁
• 申請（專利權）人: 思拓凡生物工藝研發有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/62
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 黃登高;彭昶

本發明涉及主要在層析領域的蛋白質純化。更確切地，本發明涉及使用具有改善的C?內含肽標簽和N?內含肽配體的斷裂內含肽系統的親和層析，其中靶蛋白可以作為具有天然N末端的無標簽的終產物進行純化。

技術領域

本發明涉及主要在層析領域的蛋白質純化。更確切地，本發明涉及使用具有改善的C-內含肽標簽和N-內含肽配體的斷裂內含肽(split intein)系統的親和層析，其中靶蛋白可以作為具有天然N末端的無標簽的終產物進行純化。

背景技術

內含肽是作為框內插入物表達的蛋白質元件，其中斷酶序列并催化其自身的兩個側翼多肽的切除和連接，生成活性蛋白質。在遺傳上，內含肽以兩種不同的方式編碼：作為完整內含肽，中斷兩個側翼外顯肽序列，或作為斷裂內含肽，其中每個外顯肽和部分內含肽由兩種不同基因編碼。雖然它們作為生物工程和蛋白質純化工具具有很大的希望，但在自然界中發現的具有快速動力學性質的斷裂內含肽依賴于在內含肽-外顯肽連接處的特定氨基酸，嚴重限制了可以與內含肽融合用于天然蛋白質序列的親和純化和回收的蛋白質。特別地，來自點形念珠藻的原型斷裂內含肽DNAE顯示出適合于蛋白質純化應用的動力學性質。然而，它的活性依賴于在C-外顯肽中的+2位置處的苯丙氨酸。這種依賴性嚴重縮小并損害了它的普遍適用性。

內含肽已被改造為實現生物技術中的幾個重要功能，包括作為自切割蛋白質用于重組蛋白質純化的應用。斷裂內含肽在這方面是特別有希望的，因為它們可以同時提供親和配體和自切割性質。在蛋白質純化中，作為純化對象的靶蛋白可以取代任一外顯肽。迄今為止，斷裂內含肽的DNAE家族已顯示對于C末端切割蛋白質純化方法的最大希望。

WO2014/004336描述了與斷裂內含肽N片段和斷裂內含肽C片段融合的蛋白質，其可以附著至支持物。固體支持物可以是顆粒、珠、樹脂或載玻片。

WO2014/110393描述了與斷裂內含肽C片段融合的目的蛋白質，使其與斷裂內含肽N片段和純化標簽接觸。N片段可以經由純化標簽附著到固相，并且討論了用于親和純化的方法。

US 10 066027描述了蛋白質純化系統和該系統的使用方法。公開的是包含N末端內含肽區段和C末端內含肽區段的斷裂內含肽，所述N末端內含肽區段可以是固定的，所述C末端內含肽區段具有自切割性質且可以附著至目的蛋白質。N末端內含肽區段提供有增強敏感性的基序，所述基序致使其對外在條件更敏感。

US 10 308 679描述了包含N-內含肽多肽和N-內含肽溶解配偶體的融合蛋白，以及包含此類融合蛋白的親和基質。

WO 2018/091424描述了用于生產親和層析樹脂的方法，所述親和層析樹脂包含氨基末端(N末端)的斷裂內含肽片段作為親和配體，所述方法包括下述步驟：a)在細菌細胞優選大腸桿菌中，作為包涵體中的不溶性蛋白質表達N末端的斷裂內含肽片段蛋白質，b)收獲所述包涵體；c)使所述包涵體溶解并釋放所表達的蛋白質；d)在固體支持物上結合所述蛋白質；e)使所述蛋白質重折疊；f)從固體支持物中釋放所述蛋白質；并且g)將所述蛋白質作為配體固定到層析樹脂上，以形成親和層析樹脂。該程序使得能夠固定2-10 mg/ml樹脂的配體密度。

如上所述，已使用組合的親和標簽和標簽切割機制，將斷裂內含肽用于蛋白質純化。然而，此類系統的效用受到幾個因素的限制。首先，在預期產物的剪接點處存在氨基酸需求，即需要在C-外顯肽的+2位置中的Phe，以進行切割和實現無標簽蛋白質的純化。在N末端上沒有外來氨基酸的重組蛋白質生產是高度期望的。其次，釋放蛋白質的切割必須足夠快速并提供可接受的產率。第三，存在斷裂內含肽N或C片段的溶解度需求，用于其附著至固體支持物。第四，迄今為止不存在適合于無標簽蛋白質的大規模純化的可用斷裂內含肽系統。

發明內容

本發明克服了現有技術中的缺點，并且能夠使用斷裂內含肽系統，在僅一個快速親和層析步驟中，對無標簽/天然蛋白質進行通用純化。