[發明專利]用于DNA和RNA修飾和功能基序的富集和檢測的方法和試劑盒

在審

• 申請號: 202080049544.0
• 申請日: 2020-12-23
• 公開（公告）號: CN114072525A
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: 本杰明·F·德拉特;埃迪·W·亞當斯;約瑟夫·M·費爾南德斯
• 申請（專利權）人: 艾躍生物科技公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6869;C12Q1/6816
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 韋昌金;鄭霞

1.一種方法，包括：

a)將樣品中靶核酸分子中非靶形式的胞嘧啶和/或經修飾的胞嘧啶化學轉化或酶促轉化為非胞嘧啶殘基，以產生轉化的核酸分子；

b)通過將一組引物與變性、轉化的核酸分子雜交并延伸所述引物來對所述變性、轉化的核酸分子進行第二鏈合成，以產生雙鏈核酸分子；

其中所述引物包含核苷酸序列5’-XnG-3’和/或5’-X(n-1)CG-3’，其中X是任何堿基，且n＝2至25；和

c)分析所述雙鏈核酸分子。

2.根據權利要求1所述的方法，其中n＝5至20，或4至9，或5。

3.根據權利要求1所述的方法，其中所述引物是六聚體。

4.根據權利要求1所述的方法，其中X可以是N、H、I、Q或J中的任何一個。

5.根據權利要求1所述的方法，其中XnG或X(n-1)CG選自NnG或N(n-1)CG、HnG或H(n-1)CG、InG或I(n-1)CG、QnG或Q(n-1)CG、JnG或J(n-1)CG或其組合。

6.根據權利要求1所述的方法，其中XnG為5’-NNNNNG-3’或5’-HHHHHG-3’，且X(n-1)CG為5’-NNNNCG-3’或5’-HHHHCG-3’。

7.根據權利要求1所述的方法，其中所述引物是六聚體。

8.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其中該組引物對于序列XnG或X(n-1)CG是完全簡并的。

9.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶核酸分子包括人類DNA。

10.根據權利要求1所述的方法，其中所述核酸來自病理性組織或細胞，例如癌細胞。

11.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶核酸分子包括純化的DNA或RNA，或者染色質。

12.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶核酸具有在約150個核苷酸和約700個核苷酸之間的長度。

13.根據權利要求1所述的方法，其中化學或酶促轉化包括用亞硫酸氫鹽、十-十一易位甲基胞嘧啶雙加氧酶(“TET”)和AID/APOBEC類酶的酶(例如APOBEC3A(“A3A”))中的一種或更多種來處理。

14.根據權利要求1所述的方法，其中胞嘧啶的靶形式包括5-甲基胞嘧啶(“5mC”)、5-羥甲基胞嘧啶(“5hmC”)、5-甲酰基胞嘧啶(“5fC”)和5-羧基胞嘧啶(“5caC”)中的一種或更多種。

15.根據權利要求1所述的方法，其中化學轉化或酶促轉化包括將除5mC和5hmC以外的胞嘧啶形式轉化為尿嘧啶。

16.根據權利要求1所述的方法，其中化學轉化或酶促轉化包括將除5hmC以外的胞嘧啶形式轉化為尿嘧啶。

17.根據權利要求1所述的方法，其中化學轉化或酶促轉化包括將胞嘧啶轉化為尿嘧啶，但不將5mC、5hmC、5fC或5caC轉化為尿嘧啶。

18.根據權利要求1所述的方法，其中所述非胞嘧啶殘基是尿嘧啶。

19.根據權利要求1所述的方法，其中所述引物包括DNA、RNA、LNA或PNA。

20.根據權利要求1所述的方法，其中所述引物包含經修飾的核糖或脫氧核糖。