[發明專利]用于DNA和RNA修飾和功能基序的富集和檢測的方法和試劑盒

在審

• 申請號: 202080049544.0
• 申請日: 2020-12-23
• 公開（公告）號: CN114072525A
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: 本杰明·F·德拉特;埃迪·W·亞當斯;約瑟夫·M·費爾南德斯
• 申請（專利權）人: 艾躍生物科技公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6869;C12Q1/6816
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 韋昌金;鄭霞

本文提供了用于對核酸中經修飾的核苷酸殘基進行作圖的方法。該方法包括提供核酸樣品，其中非靶修飾或靶修飾的和未修飾的核苷酸殘基被轉化為不同核苷酸的形式(諸如“C”被轉化為“T”)。然后使用一組錨定堿基引物對轉化的核酸進行第二鏈合成。一組錨定堿基引物中的每個引物在3’末端包含一個或更多個與靶核苷酸(例如，“G”或“CpG”)互補的錨定堿基，以及選自序列組的核苷酸序列，該序列組可以是完全或部分簡并的序列組。例如，序列可以是5’?XnG?3’和/或5’?X(n?1)CG?3’，其中X是任何堿基，且n＝2至25。雙鏈核酸產物可以例如通過擴增和高通量測序來分析。

相關申請的引用

本申請要求2019年12月23日提交的美國臨時申請62/953,080的優先權日的權益，其內容通過引用以其整體并入本文。

背景

表觀遺傳學是指細胞和生物體之間不是由遺傳差異造成的表型差異。DNA中的甲基化模式會導致表型的表觀遺傳差異，導致例如基因表達模式的變化。DNA的甲基化通常發生在胞嘧啶殘基。這包括例如5位碳的甲基化。這種甲基化的形式包括5-甲基胞嘧啶(“5mC”)和5-羥甲基胞嘧啶(“5hmC”)。5-甲基胞嘧啶的更多氧化形式包括5-甲?；奏?“5fC”)和5-羧基胞嘧啶(“5caC”)。胞嘧啶的甲基化通常發生在CpG位點—此處核苷酸序列是“CG”。CpG位點往往以簇的形式出現，被稱為“CpG島”。在人類中，約70％的遺傳啟動子包含CpG島。啟動子CpG島中多個甲基化CpG位點的存在導致基因的穩定沉默。已知甲基化與癌癥和衰老有關。在癌癥中，基因沉默可能是由于啟動子島的高度甲基化。

DNA甲基化模式的作圖已經成為重要的研究領域。當前正在使用若干種作圖。這些方法中一個共同的入口是將DNA分子中各種形式的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，對轉化的分子進行測序，并通過例如作圖技術將所得序列與未轉化分子的序列或基因組數據庫中的序列進行比較。

對甲基化模式進行作圖的最常見的方法中的一種是亞硫酸氫鹽測序。用亞硫酸氫鹽處理DNA將胞嘧啶殘基，而不是5-甲基胞嘧啶殘基或5-羥甲基胞嘧啶殘基轉化為尿嘧啶。因為這涉及將4-氨基基團轉化為4-羰基基團，該過程也被稱為脫氨基化。在第二鏈合成中，G與引入的U配對，并在擴增期間作為“TA”而不是“CG”增長。作圖時，序列中“C”的存在表示原始的未修飾的5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶。“T”的存在表示原始的“C”(或5-甲?；奏せ?-羧基胞嘧啶)。

該策略的變化形式包括使用十-十一易位甲基胞嘧啶雙加氧酶(“TET”)和/或APOBEC3A(“A3A”)。TET將5mC、5hmC和5fC轉化為5caC。亞硫酸氫鹽可以將5caC轉化為尿嘧啶。當與例如通過葡糖基化保護5hmC基團的方法配對時，A3A將C和5mC轉化為尿嘧啶，但不轉化5hmC。葡糖基化可以通過例如T4β-葡糖基轉移酶來進行?？梢詥为氃O計用于對5mC或5hmC進行作圖的策略。

通過多種脫氨基化策略處理的DNA可以被測序以對DNA中的甲基化位點進行作圖。一種這樣的方法是全基因組測序。然而，在可以定位基因組中的甲基化模式的意義上，全基因組測序可能是低效的。用于富集DNA中包含修飾(諸如甲基化)的DNA的方法是已知的。

現有的表觀遺傳學技術包括許多用于富集、測序和/或檢測某些核酸修飾(例如甲基化)的方法，諸如：

1.基于富集的方法(MeDIP和MBD-Seq/MIRA-Seq/MethylCap-seq)，其利用修飾特異性抗體或能夠特異性識別甲基化CpG的蛋白/蛋白結構域。

2.全基因組亞硫酸氫鹽測序

3.簡化代表性亞硫酸氫鹽測序(Reduced representationbisulfitesequencing)

4.甲基化特異性(q)PCR

5.亞硫酸氫鹽-PCR