[發明專利]組合的液相和固相DNA擴增

在審

• 申請號: 202080034226.7
• 申請日: 2020-05-07
• 公開（公告）號: CN114207146A
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: 大衛·艾倫·戴維森;格雷厄姆·沃斯利;賈勒特·基爾帕克;賽繆爾·里德
• 申請（專利權）人: DNAE診斷有限公司
• 主分類號: C12Q1/6825
• 分類號: C12Q1/6825
• 代理公司: 北京天昊聯合知識產權代理有限公司 11112
• 代理人: 張珂珂;朱雯

本申請描述了用于有效擴增并檢測群體中的某些核酸序列的方法。可以(例如)通過測序進一步表征所選擇的群體。該方法包括組合的液相和固相擴增。

技術領域

本發明涉及用于序列特異性擴增來自更廣泛的核酸序列的群體中的核酸片段亞群的方法。本發明明確地僅檢測所需的靶序列。本發明的方面涉及用于此類方法的核酸構建體。本發明描述了用于有效靶向擴增并檢測群體中的特定核酸序列的方法。

背景技術

鑒定血液和其他生物樣品中的病原體對于有效治療包括膿毒癥的多種疾病狀態至關重要。在英國，每小時有5人死于膿毒癥，并且全部膿毒癥幸存者中有25％的患者遭受永久的、改變人生的后果。早期檢測并鑒定細菌感染的病原體對于預防膿毒癥的發作和成功治療膿毒癥是必要的。檢測并鑒定血源性感染的現有方法包括血液培養和使用抗生素敏感性試驗。這些方法包括細胞的培養，這在時間和金錢這兩者上都是昂貴的。通常，在可以獲得細胞培養結果之前，將發生膿毒性休克。

諸如PCR之類可以通過分析病原體的核酸鑒定樣品中病原體的現有分子檢測方法的應用受到低的總靈敏度水平的限制。當分析人類樣品時，由于存在大量的非靶(人類)核酸，因此這尤其是個問題。這些非靶核酸可以抑制靶(病原體)核酸的下游純化和擴增，導致假陰性結果，或由于非特異性擴增而給出病原體核酸的假陽性讀數。

例如，存在幾種抗生素抗性基因，其由于點突變或其他多態性而具有多種變體，并且其中特定突變的存在可以引起與另一突變相比不同的治療策略。因此，重要的是，以及時和成本有效的方式進行這些多態性的鑒定。使用PCR和其他擴增反應的現有鑒定策略能力有限，并且實驗室可以采用測序以闡明內部序列并鑒定多態性--其實施時耗時且昂貴。因此，相對于非靶核酸，選擇性擴增靶核酸的群體對于醫藥行業和研究具有重大價值。

擴增反應通常依賴于用于待擴增的各所需序列的一對擴增引物。雖然可以組合幾對非固定化的引物，但是由于引物之間的交叉雜交，組合大量引物對通常是不可行的。因此，通常使用單獨溶液部分中的單獨引物進行多重PCR，從而需要大量的樣品。本發明描述了對擴增反應的改進，該擴增反應的改進能夠在單個樣品量中對多種不同的引物進行序列選擇性擴增。

還公開了用于乳液PCR的方法，其中稀釋單個模板，使得油乳液中的水泡平均每個水泡包含少于一個模板分子。可以包括具有單個固定化的引物的水珠，第二引物在溶液中。因此，使用兩種引物的混合物進行擴增，其中一種引物是固定化的，并且另一種引物在溶液中。然而，與本文所述方法中進一步擴增第一擴增產物的情況相反，其僅在每個反應部分中產生單個擴增產物。

還已知其中兩種引物都是固定化的擴增方法，例如基于Illumina簇的橋接擴增。在這種情況下，在游離溶液中沒有引物。

發明內容

本發明提供了雙相擴增反應，包括固相和液相這兩者的(熱循環或等溫)擴增反應，該擴增反應可以使用固定化的和非固定化的引物以及靶DNA模板的組合，以在溶液中和表面上同時生成DNA擴增子。可以在擴增后的終點試驗中或實時檢測擴增子的存在或不存在。這種雙相方法不同于包括乳液PCR的現有技術，因為它包括固相(即基于表面的)擴增和液相擴增。

可以使用一種或以上非固定化的引物擴增核酸樣品。該液相生成的DNA以及靶DNA模板也可以作為或隨后作為在固相上用于附加反應的模板，由此，作為DNA擴增反應的一部分，一個或以上固定化的引物與液相模板相互作用。通過將不同序列的引物固定在已知位置，并使用能夠辨別該位置的檢測系統(例如，使用CMOS IC芯片上的ISFET或基于熒光/光學成像系統的陣列)，讀數為系統提供了進一步的辨別能力。

在此，我們提出了一種新方法，以實現來自更廣泛的核酸序列的群體中的核酸片段的亞群的多重序列特異性擴增。

本申請描述了一種方法，包括用于擴增并分析核酸序列的方法，該方法包括：