[發明專利]組合的液相和固相DNA擴增

在審

• 申請號: 202080034226.7
• 申請日: 2020-05-07
• 公開（公告）號: CN114207146A
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: 大衛·艾倫·戴維森;格雷厄姆·沃斯利;賈勒特·基爾帕克;賽繆爾·里德
• 申請（專利權）人: DNAE診斷有限公司
• 主分類號: C12Q1/6825
• 分類號: C12Q1/6825
• 代理公司: 北京天昊聯合知識產權代理有限公司 11112
• 代理人: 張珂珂;朱雯

1.一種用于擴增并分析核酸序列的方法，包括：

a.使具有液體部分的系統與固體載體接觸，其中所述液體部分包含核酸樣品、兩種或以上非固定化的擴增引物和用于核酸擴增的試劑，并且所述固體載體具有一種或以上固定化的擴增引物；

b.使用所述非固定化的擴增引物進行核酸擴增反應，以產生第一非固定化的核酸擴增產物；

c.使用所述一種或以上固定化的擴增引物進一步擴增所述第一非固定化的核酸擴增產物，以產生固定化的第二核酸擴增產物；

d.以下兩者中的一者

i.實時查詢在所述固定化的第二核酸擴增產物處產生的定位信號，或者

ii.除去所述液體部分和第一非固定化的擴增產物，并替換為具有與所述固定化的第二核酸擴增產物雜交的引物的新液體部分，以及以下兩者中的一者

1.直接檢測所述雜交引物，或者

2.使包含至少一種核苷酸的溶液流過所述固定化的第二擴增產物以延伸所述雜交引物，以及

e.檢測所述第二核酸擴增產物的存在、不存在或序列。

2.根據權利要求1所述的方法，其中在擴增之前從所述固相中釋放所述液體部分中的所述非固定化的擴增引物。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中使用非固定化的引物的核酸擴增反應使用兩對或以上非固定化的引物。

4.根據權利要求1所述的方法，其中通過熱循環進行所述擴增。

5.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中使用所述非固定化的引物的核酸擴增反應為等溫擴增。

6.根據權利要求5所述的方法，其中通過進一步的等溫擴增產生所述第二擴增產物。

7.根據權利要求5所述的方法，其中通過熱循環產生所述第二擴增產物。

8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中通過實時查詢產生的定位信號進行所述固定化的第二核酸擴增產物的擴增。

9.根據權利要求8所述的方法，其中溶液中的兩種引物以不同的濃度存在從而產生不對稱擴增。

10.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述與所述第二核酸擴增產物雜交的引物是經熒光標記的。

11.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中通過檢測核苷酸摻入時釋放的質子檢測所述擴增產物。

12.根據權利要求11所述的方法，其中所述檢測使用ISFET傳感器。

13.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述擴增產物的檢測包括熒光報告探針和隨后的熒光測定。

14.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中使用具有相同核酸序列的擴增引物獲得所述第一擴增產物和所述第二擴增產物。

15.根據權利要求1至13中任一項所述的方法，其中所述固定化的擴增引物擴增所述第一擴增產物的內部段，使得所述第二擴增產物比所述第一擴增產物短。

16.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第一液體部分暴露于兩種或以上固定化的擴增引物中，其中各引物擴增不同的序列。

17.根據權利要求16所述的方法，其中所述兩種或以上固定化的擴增引物相差單個堿基，從而檢測所述第一核酸擴增產物中的單堿基變體。

18.根據權利要求16或權利要求17所述的方法，其中所述固定化的引物位于開放微陣列。