[發明專利]一種核酸適配體光波導傳感器及應用其的檢測方法

有效

• 申請號: 202080001217.8
• 申請日: 2020-03-16
• 公開（公告）號: CN112400112B
• 公開（公告）日: 2022-10-28
• 發明（設計）人: 婁新徽;趙家興;陸張偉;王朔
• 申請（專利權）人: 首都師范大學
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/50
• 代理公司: 北京展翅星辰知識產權代理有限公司 11693
• 代理人: 王文生

本發明涉及一種具有靶標原位富集和純化功能的核酸適配體光波導傳感器及基于小分子靶標和與核酸適配體互補短鏈DNA與偶聯在光纖表面的核酸適配體競爭性結合，實現對小分子靶標的定量檢測的方法。通過將光波導傳感器的二氧化硅纖維進行脫氧核糖核酸適配體和固相微萃取層修飾，實現核酸適配體與靶標的特異性結合與靶標在原位高效富集純化同步進行。無需任何基于酶的信號放大反應，對多種小分子靶標實現具有超高靈敏度和超高特異性的快速檢測。檢出限非常低，有優越普適性。可用于復雜樣本中靶標直接檢測，僅需對液體樣品進行稀釋，無需樣品前處理，檢測靈敏度均滿足食品和環境中對各靶標的限量標準。檢測時間短，傳感器再生速度快，可重復使用。

技術領域

本發明涉及一種核酸適配體光波導傳感器,特別是一種具有靶標原位富集和純化功能的核酸適配體光波導傳感器(SPME-OWS)，利用該傳感器實現了對多種不同水溶性小分子靶標的具有超高靈敏度和超高特異性的快速檢測，屬于分析化學技術領域。

背景技術

有機小分子是環境和食品污染物中的一大類，具有種類及其多樣、水溶性差異大、特異性抗體少等特點，因而在分析測試中主要采用基于大型儀器的方法，比如氣相色譜法、高效液相色譜法(HPLC)、氣相質譜聯用法、液相質譜聯用法等。這些方法設備昂貴，對工作環境和設備維護要求高，不適合現場檢測。近些年來，為了滿足對小分子靶標的快速檢測，各種生物傳感器發展迅速。

核酸適配體是通過SELEX技術(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment,即系統指數富集的適配體系統進化技術)獲得的單鏈或雙鏈的DNA或RNA(Nature,1990,346,818-822；Nature,1992,355,564-566)。核酸適配體能夠特異性識別包括蛋白質、小分子、細胞和組織在內的多種多樣的靶分子，其化學穩定性高，易于合成和修飾，成本低，在生物傳感領域具有廣泛的應用前景。由于小分子的高特異性抗體不易獲得，用于小分子檢測的核酸適配體生物傳感器尤其具有吸引力。但是小分子的核酸適配體的親和力普遍比抗體的低很多，通常需要進行基于酶或者納米材料的信號放大來提高檢測的靈敏度，但檢測的靈敏度常常還是不能達到實際需要的水平。

光波導傳感器是一類便攜式的熒光傳感器。主要基于激光以一定入射角由光密物質進入光疏物質時發生光的全反射，部分激發光會在與光纖垂直方向上進行傳輸，這部分光的強度隨著離開光纖的距離呈現指數遞減，被稱為倏逝波。倏逝波可以激發位于倏逝波傳播范圍內(倏逝波場)的熒光基團。這樣將能夠特異性識別靶標的抗體、受體、核酸適配體的互補鏈或者靶標分子固定在光纖的表面，將靶標分子、核酸適配體或者抗體進行熒光標記，就可以實現對靶標的定量熒光檢測。光波導傳感器操作簡單、快速、已經實現產業化、傳感界面可以進行上百次的再生，因而非常適合廉價的環境和食品中污染物的檢測。但是目前的檢測靈敏度大多在納摩爾每升的水平，還不能達到復雜介質中小分子污染物的限量標準。

萃取技術是基于儀器的分析方法中常用的樣品制備方法，用來去除基質和富集靶標，從而實現對靶標的定量或者定性檢測。固相微萃取技術(SPME)是近些年來快速發展的一類新型的萃取技術。其利用固定在固相上的各種富集材料來富集和純化各種類型的靶標(Trac-Trends in Analytical Chemistry 2018,108,154-166.Trac-Trends inAnalytical Chemistry 2019.110,66-80.)。

發明內容

為了克服現有技術中的缺陷,在本發明中，我們首次將SPME與核酸適配體相結合，以光波導傳感器為例，通過將靶標的富集和純化與檢測同步進行，實現對小分子靶標的超靈敏和高特異性檢測。實現了對多種復雜基質樣品中小分子的定量檢測，檢出限均低于國家限量標準20倍以上。而且無需復雜的樣品前處理，液體樣品只需稀釋，固體樣品只需要進行萃取。本發明方法具有巨大的實際應用前景。