[發明專利]一種促進蛋白二聚體形成的拉鏈扣結構及其應用

在審

• 申請號: 202080000784.1
• 申請日: 2020-04-26
• 公開（公告）號: CN111655734A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 楊翔;樓建榮;謝桂華
• 申請（專利權）人: 廣州市雷德生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K14/35;C07K14/00;G01N33/68;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 薛建強;許飛

本發明屬于基因工程領域，涉及一種促進蛋白二聚體形成的拉鏈扣結構及其應用，該拉鏈扣可用于同種蛋白的二聚，異種蛋白的二聚，也可用于多肽成環，二聚多肽及多肽的延伸。一些實例可以得到接近天然構象的ESAT6?CFP10二聚體，該二聚體具有更好的可溶性，對記憶性T細胞刺激效果要好于線性融合表達的ESAT6?CFP10蛋白。發明人還發現，二聚體拉鏈扣可幫助形成更穩定的環型多肽，添加了二聚體扣的CCP多肽可以增加對類風濕關節炎病人血清中瓜氨酸化自身抗體的檢出率。

技術領域

本發明涉及生物領域，特別具體涉及蛋白領域，特別涉及一種促進蛋白二聚體形成的拉鏈扣結構及其應用。

背景技術

蛋白二聚體是一種蛋白質四級結構。同源雙聚體是由兩個相同的蛋白分子組合而成(此過程稱為同源二聚作用homodimerization)，而異源二聚體則是由兩種不同的蛋白質所形成(稱為異源二聚作用heterodimerization)。生物化學中的大部分雙聚體都不是用共價鍵相連結的。例如，反轉錄酶為一種非共價鍵連接的異源二聚體酵素，是由兩種不同的氨基酸鏈連結的。另一個例外為雙聚體蛋白NEMO，由雙硫鍵連結的雙聚體。有些蛋白會包含特殊的區域，確保二聚作用(二聚區域)的形成。在細胞的生長，繁殖，信號傳導中，蛋白的二聚對功能的實現有重要的作用。研究蛋白的二聚體對了解蛋白的功能，生產應用十分重要。設計蛋白質二聚體是一項挑戰性十足的任務。

目前公布的設計蛋白二聚體的方法有半胱氨酸結設計，3個以上的成不對稱的奇數的半胱氨酸殘基，位于目標蛋白的C端(Sherilyn L，2001)，這種方法親和力高，但蛋白不穩定，易多聚沉淀；Knob-in-hole設計，改造自抗體的Fc片段，在雙特異性單抗開發中有應用(Elliot JM.2014)；亮氨酸拉鏈是出現在DNA結合蛋白質和其它蛋白質中的一種結構基元(motif)，即模體，這種蛋白上的亮氨酸總是有規律地每隔7個氨基酸就出現一次。蛋白質α-螺旋每繞一圈為3.6個氨基酸殘基。這種一級結構形成α-螺旋時，亮氨酸必與螺旋軸平行而在外側同一線上排布，每繞兩圈出現一次，兩組平行走向，帶亮氨酸的α-螺旋形成的對稱二聚體。其上的亮氨酸殘基，側鏈上R-基因的分支碳鏈，又剛好互相交錯排列，故名氨酸拉鏈。這種結構融合蛋白部分太大，不適合作為二聚體的融合蛋白。二硫鍵常常用于蛋白的二聚體設計中，但它帶來的問題常常超過了益處。很多蛋白本身就有半胱氨酸存在，這些半胱氨酸與蛋白的三維結構，功能發揮起著巨大的作用，在蛋白表達出來時，多余設計進去的二硫鍵會干擾重組蛋白的正確折疊，造成蛋白包涵體出現。特別的，多余的半胱氨酸還會造成多聚體的出現。

天然蛋白的三維結構十分復雜，除了離子鍵的相互作用，氫鍵，疏水氨基酸之間的相互作用力占主導地位。蛋白與蛋白之間的相互作用更多的需要天然三維結構的互補才能形成穩定的二聚體結構。這對重組蛋白二聚體的形成提出了更高的要求。

FLAG標簽是是常用的用于檢測蛋白表達的標簽，也常常用于重組蛋白的純化，其氨基酸序列為DYKDDDDK。His標簽是指六個組氨酸殘基組成的融合標簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當某一個標簽的使用，一是能構成表位利于純化和檢測；二是構成獨特的結構特征(結合配體)利于純化。組氨酸殘基側鏈與固態的鎳有強烈的吸引力，可用固定化金屬螯合層析填料(IMAC)對帶His標簽的重組蛋白進行親和分離純化。其他常用的標簽還有V5標簽，GKPIPNPLLGLDST；S標簽：KETAAAKFERQHMDS；Myc標簽：EQKLISEEDL；HA標簽：YPYDVPDYA；MBP標簽等等。

一些基因5'端具有一段較短的RNA序列(約150-250bp)，這類RNA序列能折疊成類似于起始tRNA的結構，從而介導核糖體與RNA結合，起始蛋白質翻譯，這段非翻譯RNA被稱為內部核糖體進入位點序列(Internal ribosome entry site,IRES)。在基因工程中，IRES序列常用于多基因表達。例如，在目的基因之后插入IRES序列，后面是選擇標記基因，這樣轉錄出來的mRNA就可以同時表達兩種蛋白。