[發明專利]高活性β-半乳糖苷酶的制備

在審

• 申請號: 202110044959.5
• 申請日: 2021-01-13
• 公開（公告）號: CN112608914A
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 馬金佑
• 申請（專利權）人: 馬金佑
• 主分類號: C12N9/38
• 分類號: C12N9/38;C12N15/56;C12N15/10;C12N15/70;C12N15/66;C12R1/19
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本發明涉及高活性β?半乳糖苷酶的制備，酶基因序列(β?galactosidase，GenBank:NT_166518.1)在第1983位上發生突變，由原來的A分別突變為T，其有益效果在于，獲得的突變β?半乳糖苷酶具有更高的酶活。

技術領域

本發明屬于基因工程與酶工程領域，具體涉及高活性β-半乳糖苷酶的制備。

背景技術

乳糖不耐癥是一種乳糖消化不良疾病，主要原因是生物體內缺乏乳糖酶或其活性較低，乳糖不能被乳糖酶水解成單糖，人體無法吸收，我國成年人乳糖吸收不良的發病率高達86.7％。

乳糖酶又稱為β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，可將乳糖水解為葡萄糖和半乳糖，乳糖酶的應用領域很廣，在醫藥、乳制品、免疫分析檢測、化學合成、生物、環保領域都有應用。目前公認制備乳糖酶比較安全的菌株主要有益生菌、乳酸克魯維酵母、米曲霉、黑曲霉、脆壁克魯維酵母。

國內外已經對乳糖酶進行了大量的研究工作，但尚未得到廣泛應用，主要原因有：1.乳糖酶的單位產量較低；2.市場上的乳糖酶多為胞內酶，需破碎細胞才能得到，提取純化工藝復雜，成本高；3.酶的作用溫度低、耐熱性差，工業生產中容易染雜菌，適用范圍窄。本研究主要通過提高乳糖酶的酶活，解決乳糖酶的成本問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種β-半乳糖苷酶催化活性的方法，使得β-半乳糖苷酶的酶活性有很大的提高，其具有更高的應用潛力和經濟價值。

本發明的制備過程如下：

1.從NCBI上獲得β-半乳糖苷酶序列(β-galactosidase，GenBank:NT_166518.1)，交生物公司合成，設計PCR引物F：5'-AATTAATTCGGATCCGAATTCCTGAACTCTC GCGGAATTTGA-3'，5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCATGTAGCATCTCAAT ATGATTAACT-3'，PCR反應結束后，加20μl Cloning Enhancer到PCR體系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切pET20b(+)質粒，酶切產物經過0.75％瓊脂糖凝膠電泳后回收，溶于滅菌雙蒸水中，將孵育后的PCR產物與純化的線性載體混合均勻，加入In-Fusion酶，50℃反應15min，轉化E.coli JM109，挑取陽性克隆，送生物公司測序，將鑒定正確的質粒轉化宿主E.coli BL21進行表達，得到含有野生型序列質粒的基因工程菌；

2.質粒DNA的提取

將攜帶有質粒pET20b(+)/β-galactosidase的E.coli BL21基因工程菌接種于LB/Am p(Amp終濃度100μg/mL)液體培養基中，于37℃，200r/min過夜培養后，使用質粒小量提取試劑盒抽提質粒，具體操作按照說明書進行；

3.易錯PCR擴增與突變文庫的構建