[發(fā)明專利]一種用于核酸原位雜交信號(hào)放大的單鏈DNA制備方法及二級(jí)放大的單鏈DNA制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011645412.2
• 申請(qǐng)日: 2020-12-31
• 公開（公告）號(hào): CN112662738B
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊杰;吳颯;曹冬建;奚彩麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12Q1/6841;C12Q1/682;C12N15/11
• 代理公司: 北京眾達(dá)德權(quán)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11570
• 代理人: 劉杰

本發(fā)明提供了一種用于核酸原位雜交信號(hào)放大的單鏈DNA制備方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。所述制備方法包括：以基因識(shí)別引物、第一磷酸化環(huán)化引物和DNA連接酶為原料，進(jìn)行連接反應(yīng)；連接反應(yīng)完成后加入Bst DNA聚合酶和dNTP，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)溫度為45?55℃，反應(yīng)時(shí)間為1?3h，獲得用于核酸原位雜交信號(hào)放大的單鏈DNA；其中，所述第一磷酸化環(huán)化引物包含片段C，所述C的局部片段與第一熒光探針的核酸片段序列相同；或者，所述C的局部片段與二級(jí)放大單鏈DNA的局部片段核苷酸序列相同。該方法具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用、步驟簡(jiǎn)單和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明還提供一種用于核酸原位雜交信號(hào)二級(jí)放大的單鏈DNA制備方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于核酸原位雜交信號(hào)放大的單鏈DNA制備方法及二級(jí)放大的單鏈DNA制備方法。

背景技術(shù)

熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)是一種基于DNA或DNA/RNA雙鏈互補(bǔ)性質(zhì)的核酸分子識(shí)別技術(shù)。熒光原位雜交可應(yīng)用于細(xì)胞中RNA分子的定位與表達(dá)豐度的檢測(cè)，是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)與臨床的疾病檢測(cè)中常用的檢測(cè)與分析方法。盡管之前的研究已經(jīng)報(bào)道了關(guān)于FISH相關(guān)的檢測(cè)技術(shù)，也表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定性與檢出率。但從綜合性能方面來說，以前的FISH不論在成本、步驟復(fù)雜性和信號(hào)強(qiáng)度方面都表現(xiàn)出或多或少的缺點(diǎn)。

現(xiàn)有的幾種FISH放大技術(shù)，如分支DNA，HCR，ClampFISH，SABER等，均存在一定局限性，具體如下：

1)分支DNA也叫bDNA(branch DNA)，是一種通過DNA合成儀合成的一種支鏈DNA，在DNA化學(xué)合成過程中在已經(jīng)合成的一個(gè)臂(莖)連接在5′末端的分支點(diǎn)上引入支鏈單體修飾來合成多個(gè)其他臂(枝)連接在3′末端繼續(xù)合成。雖然這種方法被廣泛應(yīng)用，但從費(fèi)用方面考慮，由于需要合成分支狀的DNA寡聚核苷酸，成本較高。

2)HCR(Hybridization Chain Reaction)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是利用互補(bǔ)配對(duì)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的熒光探針分子進(jìn)行雜交反應(yīng)來放大熒光信號(hào)；但要設(shè)計(jì)相互不干擾的多重發(fā)卡結(jié)構(gòu)的熒光探針具有一定的難度，而且由于放大的信號(hào)有限。

3)CIampFISH技術(shù)利用一種click化學(xué)反應(yīng)形成環(huán)形DNA后，通過多輪處理后逐級(jí)放大的一種方法[3]；但ClampFISH合成在DNA的兩端都合成有click修飾的引物，合成費(fèi)用也非常高。

4)SABER是一種通過PER擴(kuò)增的來實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的方法，在體外擴(kuò)增單鏈DNA，對(duì)熒光結(jié)合序列進(jìn)行重復(fù)延伸，使其在拷貝數(shù)量上得到放大。但這種方法在編碼能力上具有一定的限制，而且也需要合成一種iso-dG或so-dC修飾和3′端修飾的發(fā)卡狀DNA。

以上方法在性能上都各自存在著一些局限性。要實(shí)現(xiàn)靈敏、低成本地實(shí)現(xiàn)RNA信號(hào)檢測(cè)，對(duì)FISH檢測(cè)提出了新的挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有FISH放大技術(shù)成本高、步驟復(fù)雜、信號(hào)強(qiáng)度弱的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種用于核酸原位雜交信號(hào)放大的單鏈DNA制備方法，該方法具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用、步驟簡(jiǎn)單、穩(wěn)定和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還提供了一種用于核酸原位雜交信號(hào)二級(jí)放大的單鏈DNA制備方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明實(shí)施例提供一種用于核酸原位雜交信號(hào)放大的單鏈DNA制備方法，所述制備方法包括：

以基因識(shí)別引物、第一磷酸化環(huán)化引物和DNA連接酶為原料，進(jìn)行連接反應(yīng)；

連接反應(yīng)完成后加入Bst DNA聚合酶和dNTP，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)溫度為45-55℃，反應(yīng)時(shí)間為1-3h，獲得用于核酸原位雜交信號(hào)放大的單鏈DNA；

其中，所述第一磷酸化環(huán)化引物包含片段C，所述C的局部片段與第一熒光探針的核酸片段核苷酸序列相同；