[發(fā)明專利]一種用于核酸原位雜交信號放大的單鏈DNA制備方法及二級放大的單鏈DNA制備方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011645412.2 | 申請日： | 2020-12-31 |
| 公開（公告）號： | CN112662738B | 公開（公告）日： | 2023-03-21 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 楊杰;吳颯;曹冬建;奚彩麗 | 申請（專利權(quán)）人： | 華中科技大學(xué) |
| 主分類號： | C12Q1/6806 | 分類號： | C12Q1/6806;C12Q1/6841;C12Q1/682;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京眾達德權(quán)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11570 | 代理人： | 劉杰 |
| 地址： | 430074 湖北*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 用于 核酸 原位雜交 信號 放大 dna 制備 方法 二級 | ||
1.一種用于核酸原位雜交信號二級放大的單鏈DNA制備方法，其特征在于，所述制備方法包括：
以基因識別引物、第一磷酸化環(huán)化引物和DNA連接酶為原料，進行連接反應(yīng)；
連接反應(yīng)完成后加入Bst DNA聚合酶和dNTP，進行滾環(huán)擴增反應(yīng)，反應(yīng)溫度為45-55℃，反應(yīng)時間為1-3h，獲得用于核酸原位雜交信號放大的單鏈DNA；
以二級放大識別引物、第二磷酸化環(huán)化引物和DNA連接酶為原料，進行二級放大連接反應(yīng)；
二級放大連接反應(yīng)完成后加入Bst DNA聚合酶和dNTP，進行二級放大滾環(huán)擴增反應(yīng)，反應(yīng)溫度為45-55℃，反應(yīng)時間為1-3h，獲得用于核酸原位雜交信號二級放大的單鏈DNA；
其中，所述第一磷酸化環(huán)化引物包含片段C，所述片段C的局部片段與二級放大單鏈DNA的局部片段核苷酸序列相同；
所述用于核酸原位雜交信號放大的單鏈DNA和用于核酸原位雜交信號二級放大的單鏈DNA長度為750bp；
所述基因識別引物的5'端包含片段A，3'端包含片段B1和B2，所述片段A與待測DNA或待測RNA的局部片段堿基互補；
所述第一磷酸化環(huán)化引物的兩端分別為片段B1'和B2'，所述片段B1'和所述片段B2'之間的序列包含片段C，所述片段B1與所述片段B1'堿基互補，所述片段B2與所述片段B2'堿基互補；
所述二級放大識別引物的5'端為片段E,所述片段E與用于核酸原位雜交信號放大的單鏈DNA中的片段C的局部片段核苷酸序列相同，所述二級放大識別引物的3'端包含片段F1和F2；
所述第二磷酸化環(huán)化引物的兩端分別為片段F1'和F2'，所述片段F1'和所述片段F2'之間的序列包含片段D，所述片段D與第二熒光探針的核酸片段核苷酸序列相同，所述片段F1與所述片段F1'堿基互補，所述片段F2與所述片段F2'堿基互補。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于核酸原位雜交信號二級放大的單鏈DNA制備方法，其特征在于，所述以基因識別引物、第一磷酸化環(huán)化引物和DNA連接酶為原料，進行連接反應(yīng)，具體包括：
將基因識別引物、第一磷酸化環(huán)化引物、DNA連接酶緩沖液和退火緩沖液混合，90-95℃熱處理3-5min，以0.1-0.4℃/min的冷卻速度冷卻至25-37℃，后加入DNA連接酶進行連接反應(yīng)，反應(yīng)溫度為25-37℃，反應(yīng)時間為4-12h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于核酸原位雜交信號二級放大的單鏈DNA制備方法，其特征在于，所述基因識別引物中：
所述片段A為如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:10中任意一項所示的核苷酸序列；
所述片段B1為如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；
所述片段B2為如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；
所述第一磷酸化環(huán)化引物中：
所述片段B1'為如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；
所述片段B2'為如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；
所述片段C為如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于核酸原位雜交信號二級放大的單鏈DNA制備方法，其特征在于，所述用于核酸原位雜交信號放大的單鏈DNA，一端包含片段A，另一端包含若干個片段C',所述片段C'與DNA片段C堿基互補，所述片段A為如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:10中任意一項所示的核苷酸序列，所述片段C為如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于核酸原位雜交信號二級放大的單鏈DNA制備方法，其特征在于，所述以二級放大識別引物、第二磷酸化環(huán)化引物和DNA連接酶為原料，進行二級放大連接反應(yīng)，具體包括：
以二級放大識別引物、第二磷酸化環(huán)化引物和DNA連接酶為原料，90-95℃熱處理3-5min，以0.1-0.4℃/min的冷卻速度冷卻至25-37℃，后加入DNA連接酶進行二級放大連接反應(yīng)，反應(yīng)溫度為25-37℃，反應(yīng)時間為4-12h。
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